菊花蜂花粉多糖的分离纯化及抗肿瘤活性研究

王　博，张梦珊，张中玉，李珊珊1,,*

(1.中国农业科学院 特产研究所,吉林长春 130112;2.北华大学 化学与生物学院,吉林吉林 132013;3.东北师范大学生命科学学院,吉林长春 130024)



菊花蜂花粉多糖的分离纯化及抗肿瘤活性研究

王博1,2,3，张梦珊3，张中玉3，李珊珊1,3,*

(1.中国农业科学院 特产研究所,吉林长春 130112;2.北华大学 化学与生物学院,吉林吉林 132013;3.东北师范大学生命科学学院,吉林长春 130024)

本文对蜂花粉多糖进行了分离纯化和组成分析,并初步分析了各多糖级分对肿瘤细胞增殖的抑制作用。选取菊花蜂花粉为原料,通过水提、醇沉得到总多糖WDPP,再通过离子交换层析得到一个中性糖(WDPP-N)和两个酸性糖级分(WDPP-1,WDPP-2)。通过高效液相色谱法测定各级分的单糖组成,通过对肿瘤细胞增殖作用的影响探讨各级分的抗肿瘤活性。结果表明,WDPP-N主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成,比例为30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1和WDPP-2都主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成,还含有少量的鼠李糖、葡萄糖等。WDPP-N和WDPP-2浓度为5 mg/mL时对肿瘤细胞HCT116增殖的抑制率分别为38%和32%,对HT-29增殖的抑制率为42%和47%,WDPP-1对肿瘤细胞增殖作用的影响不显著(p>0.05),而WDPP在浓度为5 mg/mL时对HCT116和HT-29肿瘤细胞增殖的抑制率分别为61%和81%。因此,菊花蜂花粉总多糖WDPP抑制肿瘤细胞增殖的活性优于中性糖和酸性糖。

菊花蜂花粉,多糖,分离纯化,抗肿瘤活性

蜂花粉是天然的保健食品与药品原料,作为纯天然无污染的产品,其保健功能越来越被人们所青睐。《神农本草经》和《本草纲目》中均有对花粉的保健治疗作用的记载。花粉的成分主要包括蛋白质、糖类、脂质、维生素、酚类、微量元素、生长素等[1],这些成分的种类和含量与植物来源及采收季节均有关系。荷花蜂花粉、菊花蜂花粉、五味子蜂花粉等市面上常见蜂花粉所含营养成分大致是:蛋白质20%～25%,碳水化合物40%～50%,脂肪5%～10%,矿物质2%～3%,木质素10%～15%,未知物质10%～15%[2]。多糖作为蜂花粉中重要的活性成分,具有多种生物学活性和药理作用。国内外对蜂花粉多糖的结构和活性的报道较少。山楂蜂花粉多糖能够激活巨噬细胞的吞噬活动,增强人体综合免疫功能[3];梯牧草蜂花粉多糖[4]含有20%的阿拉伯半乳聚糖蛋白,能够刺激机体的免疫应答反应;油菜蜂花粉多糖[5]能够显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长率,并可提高小鼠免疫力。除此之外,蜂花粉多糖还有抗衰老、美容、防治脑心血管疾病、减肥、调节肠胃功能、保肝护肝、调节神经系统等多种功效,对贫血、糖尿病、改善记忆力、更年期障碍等也有较好效果[6]。现有相关文献中,对蜂花粉多糖分离纯化的报道较少,缺乏系统的分析,针对上述问题设计了本文的研究内容。

本文选取菊花蜂花粉为原料,对多糖成分进行了提取和纯化,共得到一种菊花蜂花粉中性糖和两种酸性糖级分,对各级分的单糖组成和对肿瘤细胞增殖作用的影响进行了分析,探讨了不同的多糖级分在组成和抗肿瘤活性等方面的差异。本文的结果可以为蜂花粉多糖的应用提供数据基础和理论依据,也为菊花蜂花粉多糖的下一步研究提供了指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菊花蜂花粉中国农业科学院饲料研究所;人结直肠癌细胞株HCT116、人大肠癌细胞株HT29中国医学科学院基础医学研究所;单糖标准品Sigma-Aldrich公司;其它试剂均为国产分析纯。

恒流蠕动泵BT01-100保定兰格恒流泵有限公司;自动部分收集器BS-100A上海沪西分析仪器厂;低速台式离心机2-6KLSigma-Aldrich公司;CO2细胞培养箱MCO-15AC日本三洋仪器公司。

高效液相色谱仪及色谱柱:紫外检测器SPD-10Avp日本岛津仪器有限公司;溶剂输送泵,LC-10ATvp日本岛津仪器有限公司;柱温箱AT-330天津奥特赛恩斯仪器有限公司;色谱柱Shim-pack VP-ODS日本岛津仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菊花蜂花粉总多糖的提取向干燥的菊花蜂花粉(500 g)中加入8 L蒸馏水,浸泡过夜,100 ℃提取4 h,离心(4500 r/min,10 min)。沉淀加入8 L蒸馏水重复提取两次。合并三次提取所得滤液,60～80 ℃水浴浓缩至800 mL,离心(4500 r/min,10 min),弃去沉淀。向上清液加入4倍量无水乙醇,沉淀过夜。离心(4500 r/min,10 min),收集沉淀。向沉淀中加入800 mL蒸馏水,充分溶解,加入4倍量无水乙醇再次醇沉。依次用300 mL 95%乙醇、300 mL无水乙醇、100 mL乙醚洗涤。将沉淀置于有五氧化二磷的真空干燥器中,真空干燥24 h,得粉末状菊花蜂花粉总多糖(WDPP,Water-soluble Dendranthema indicum bee Pollen Polysaccharides)。

1.2.2蜂花粉多糖的分离纯化DEAE-纤维素分别用酸碱进行预处理后,装柱,依次用3倍柱体积的蒸馏水、2倍柱体积的2 mol/L NaCl和2倍柱体积的蒸馏水进行平衡,平衡流速为15 cm/h。

取10 g菊花蜂花粉多糖WDPP溶于100 mL蒸馏水中,离心后上样于平衡好的DEAE-纤维素离子交换层析柱(8.0 cm×20 cm,Cl-型),依次用2 L蒸馏水、0.2、0.4 mol/L NaCl水溶液洗脱,流速12.5 mL/min,每烧杯收集50 mL洗脱液,苯酚-硫酸法检测洗脱液中总糖含量分布[7],间羟基联苯法测定洗脱液中糖醛酸含量分布[8]。分别收集不同的洗脱峰,除盐后减压冻干,分别获得蒸馏水洗脱组分WDPP-N和0.2 mol/LNaCl溶液洗脱组分WDPP-1、0.4 mol/L NaCl溶液洗脱组分WDPP-2。

1.2.3理化性质测定采用苯酚-硫酸法测定总糖含量,间羟基联苯法测定糖醛酸的含量。

单糖组成分析[9]:称取多糖样品2 mg,依次用1 mL 1 mol/L盐酸-甲醇溶液和1 mL 2 mol/L三氟乙酸水解,PMP衍生化后,滤膜过滤,加入适量蒸馏水稀释,HPLC检测。取单糖标准品作为对照,根据出峰时间和峰面积判断待测样品单糖组成类型和比例。采用Shimadzu HPLC系统(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外可见光检测器),DIKMA Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm× 150 mm),流动相为82.0% 0.1 mol/L PBS和18.0%乙腈(v/v),流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为245 nm。

1.2.4MTT法检测菊花蜂花粉多糖各级分对肿瘤细胞体外增殖活性的影响将处于对数生长期的HCT116细胞和HT29细胞传代后,细胞密度调为2×105个/mL。向96孔板中加入50 μL细胞液,5% CO2细胞培养箱中37 ℃培养24 h。去除原培养基,加入多糖溶液,终浓度分别为0.5、2、5 mg/mL。72 h后,加入MTT染色液培养4 h,吸去上清,加入DMSO,避光振荡10 min。酶标仪检测波长为570 nm处的光吸收值,计算细胞存活率[6]。

对所得数据进行分析统计,计算均值及SD值,并用SPSS 12.0进行分析,当p<0.01时,表示实验组与对照组差异极其显著,当p<0.05时,实验组与对照组有显著性差异。

2　结果与讨论

2.1菊花蜂花粉总多糖的提取和分离纯化

500 g干燥的菊花蜂花粉经热水煮提,4倍体积乙醇沉淀,常规干燥,共得到39.5 g菊花蜂花粉总多糖(WDPP),收率为7.9%。WDPP主要由鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)及阿拉伯糖(Ara)组成(表1),还含有少量的葡萄糖醛酸(GlcA)和甘露糖(Man)。其中,半乳糖和阿拉伯糖是总多糖的主要组成成分。

通过DEAE-纤维素柱层析,对WDPP进行纯化,共得到一个中性糖级分WDPP-N和两个酸性糖级分WDPP-1、WDPP-2。其洗脱图如图1所示。

图1　WDPP经DEAE-纤维素柱层析洗脱后 总糖和糖醛酸分布曲线图Fig.1　Distribution of total carbohydrate and uronic acid of WDPP on DEAE-Cellulose column

通过DEAE-Cellulose分离纯化,共得到一种菊花蜂花粉中性糖WDPP-N及两种菊花蜂花粉酸性糖WDPP-1、WDPP-2。

中性糖WDPP-N收率为32.8%,淡黄色粉末。主要由Gal、Ara和Glc组成,比例为30.3∶31.6∶32.7,约为1∶1∶1。推测其含有阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖。同时,中性糖中还含有少量的Man。

WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)组成。Rha和GalA的比例约为1∶3,符合文献中对RG-I型果胶的定义[10-11],具有少量的RG-I和HG结构域。Gal和Ara比例约为1∶1,总量达到75%以上,推测其中含有大量的阿拉伯半乳聚糖片段。

表1　菊花蜂花粉多糖各级分收率及组成分析Table 1　Yield and monosaccharide composition of polysaccharides from bee pollen of Dendranthema indicum

注:a多糖产量与蜂花粉干物质的百分比;b该级分与上样量的百分比。

WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)组成。Rha与GalA的比例约为1∶3,含有大量的RG-I型和HG果胶。Ara含量较高,推测存在大量的阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

菊花蜂花粉中的两种酸性糖主要由Rha、GalA、Gal和Ara组成,并随着洗脱液盐浓度的增加,组成呈现规律性的变化。当洗脱液的盐浓度较小时,洗脱下来的酸性糖中鼠李糖和半乳糖醛酸比例较小,同时阿拉伯糖和半乳糖比例为1∶1。当盐浓度增大时,鼠李糖和半乳糖醛酸含量逐渐增高,同时阿拉伯糖比例上升,半乳糖比例下降。总体来说,两种菊花蜂花粉酸性糖级分都是含有阿拉伯半乳聚糖片段的RG-I型果胶,同时有少量HG结构域存在。

2.2菊花蜂花粉多糖对肿瘤细胞增殖活性的影响

菊花蜂花粉多糖对HCT116肿瘤细胞体外增殖活性的影响如图2所示。低浓度时,各级分对肿瘤细胞的抑制活性不明显,高浓度时抑制活性显著。WDPP的对HCT116肿瘤细胞的抑制活性高于中性糖及酸性糖级分。

图2　菊花蜂花粉多糖对HCT116肿瘤细胞增殖的影响Fig.2　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HCT116 cells注:*p<0.05差异显著,**p<0.01差异极显著。

菊花蜂花粉多糖对HT-29细胞的体外增殖活性影响如图3所示。WDPP、WDPP-N和WDPP-2对肿瘤细胞的抑制活性随浓度增加而增强,具有一定的浓度依赖性。WDPP浓度为5 mg/mL时肿瘤细胞存活率低于20%,抑制作用明显强于其它级分。

图3　菊花蜂花粉多糖对HT-29肿瘤细胞增殖的影响Fig.3　Anti-proliferative effects of bee pollen polysaccharides from Dendranthema indicum on HT-29 cells注:*p<0.05差异显著,**p<0.01差异极显著。

3　结论与讨论

目前关于多糖的结构、性能和活性研究越来越深入,在食品工业中的应用也越来越广泛[12]。多糖结构复杂,活性多样。不同结构的多糖具有不同的生物活性。本研究所得到的菊花蜂花粉总多糖主要由Ara(37.8%)、Gal(27.7%)、Glc(17.2%)和GalA(6.0%)组成。通过DEAE-Cellulose分离纯化,将菊花蜂花粉总多糖分离为几种不同类型的级分。WDPP-N主要由Gal(30.3%)、Ara(31.6%)和Glc(32.7%)组成,WDPP-1主要由Rha(3.4%)、GalA(9.3%)、Gal(38.6%)和Ara(37.1%)组成,WDPP-2主要由Rha(10.2%)、GalA(30.4%)、Gal(16.0%)和Ara(40.7%)组成。体外抗肿瘤活性结果表明,菊花蜂花粉总多糖在浓度为5 mg/mL时能够显著抑制HCT116和HT-29肿瘤细胞的增殖,抑制率分别为61%和81%,活性优于中性糖和酸性糖级分。本论文的研究结果能够为菊花蜂花粉有效活性成分的研究奠定基础,为蜂花粉多糖的应用提供一定的理论指导和依据,也可以为其它类型蜂花粉多糖的研究提供一定的思路。

[1]刘明,尹伟荣,杨飞,等. 蜂花粉与松花粉主要成分和食疗保健功效探讨[J]. 蜜蜂杂志,2009,7:3-5.

[2]张雨,李艳芳,周才琼. 花粉主要营养成分与保健功能[J].中国养蜂,2006,57(8):31-32.

[3]Li F,Yuan Q P,Rashid F. Isolation,purification and immunobiological activity of a new water-soluble bee pollen polysaccharide from Crataegus pinnatifida Bge[J]. Carbohydrate polymers,2009,78(1):80-88.

[4]Brecker L,Wicklein D,Moll H,et al. Structural and immunological properties of arabinogalactan polysaccharides from pollen of timothy grass(Phleum pretense L.)[J]. Carbohydrate research,2005,340(4):657-663.

[5]Yang X P,Guo D Y,Zhang J M,et al. Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide[J]. International immunopharmacology,2007,7(4):427-434.

[6]Wang B,Diao Q Y,Zhang Z Y,et al. Antitumor activity of bee pollen polysaccharides from Rosa Rugosa[J]. Molecular medicine reports,2013,7(5):1555-1558.

[7]Zhang X,Li S S,Sun L,et al. Further analysis of the structure and immunological activity of an RG-I type pectin from Panax ginseng[J]. Carbohydrate polymers,2012,89(2):519-525.

[8]Blumenkrantz N,Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids[J]. Analytical biochemistry,1973,54(2):484-489.

[9]Yu L,Zhang X,Li S S,et al. Rhamnogalacturonan I domains from ginseng pectin[J]. Carbohydrate polymers,2010,79(4):811-817.

[10]张学杰,郭科,苏艳玲. 果胶研究新进展[J]. 中国食品学报,2010,10(1):167-174.

[11]李珊珊,金银萍,姚春林,等. 人参多糖的结构与活性研究进展[J]. 中国中药杂志,2014,39(24):4709-4715.

[12]袁霖,吴肖. 生物活性多糖及其在食品中的应用前景[J].食品工业科技,2004,25(7):136-137.

Study on extraction,purification and antitumor activity of polysaccharide from bee pollen ofDendranthemaindicum

WANG Bo1,2,3,ZHANG Meng-shan3,ZHANG Zhong-yu3,LI Shan-shan1,3,*

(1.Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130012,China;2.College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013，China;3.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

The purification procedures,physiochemical features and antitumor activity of polysaccharide fractions from bee pollen ofDendranthemaindicumwere studied in this paper. Polysaccharide fractions(WDPP)was dealed with water-extraction,ethnol-precipetation and ion-exchange chromatography,then one netral(WDPP-N)and two acidic fractions(WDPP-1,WDPP-2)were obtained. The monosaccharide composition was tested through HPLC,the antitumor activity of all fractions were investigated by MTT method. WDPP-N was composed of galactose,arabinose,and glucose with a ratio of 30.3∶31.6∶32.7;WDPP-1 and WDPP-2 were mainly composed by galacturonic acid,galactose and arabinose,rhamose and glucose as small proportion. Total polysaccharide had obvious inhibition effect on HT-29 and HCT116 tumor cells in high concentration compared with neutral and acidic fractions.

bee pollen ofDendranthemaindicum;polysaccharide;extraction and purification;antitumor activity

2015-08-27

王博(1978-),女,博士研究生,讲师,研究方向:天然产物的结构和功能,E-mail:shanshanli123456@163.com。

李珊珊(1984-),女,博士研究生,助理研究员,研究方向:糖复合物的结构与功能,Email:lishanshan@caas.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.064