β-胡萝卜素/酪蛋白纳米复合物的形成及β-CE的生物利用率

张怡欣,何胜华,唐海珊,马　莺

(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)



β-胡萝卜素/酪蛋白纳米复合物的形成及β-CE的生物利用率

张怡欣,何胜华*,唐海珊,马莺

(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,黑龙江哈尔滨 150090)

β-胡萝卜素(β-CE)具有多种生物活性,但是不稳定,容易降解,利用酪蛋白(CN)对β-胡萝卜素进行自组装能够对其起到保护作用,从而提高β-胡萝卜素在食品工业中的利用价值。本文以β-CE/CN形成纳米复合物为背景,研究了其形成的影响因素、粒径分布以及β-CE的生物利用率。结果表明,β-CE/CN纳米复合物的形成受温度与β-CE/CN质量比的影响较大,β-胡萝卜素经酪蛋白自组装后,其水溶解性提高。经体外消化实验,β-CE/CN纳米复合物经胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解后,酶解产物经SDS-PAGE分析,酪蛋白随着酶解时间的延长其水解程度增加,因此β-CE从纳米复合物中更易释放出来,其生物利用率提高。

β-胡萝卜素,酪蛋白,纳米复合物,生物利用率

乳蛋白由于其价廉、无毒、高营养价值以及多种结构和功能特性使得其适合各种生物活性物质的载体[1]。酪蛋白(CN)在整个蛋白中所占比例较高,在牛乳中以胶束的形式存在。酪蛋白的自组装作用是Semo等人首次提出,随着人们对酪蛋白自组装作用的认识,利用酪蛋白自组装作用作为生物活性物质的载体也越来越受到人们的重视[2]。Zimet等人利用酪蛋白胶束和酪蛋白纳米粒子来作为多不饱和脂肪酸的载体,大大的提高了不饱和脂肪酸的稳定性[3]。Bargarum等人利用β-CN与疏水性维生素D混合,利用β-CN的自组装作用,形成了β-CN/维生素D纳米粒子复合物,其胶束的粒径接近于天然酪蛋白胶束,提高了维生素D在水介质中的稳定性,对紫外光诱导降解起到了显著的保护作用[4]。

β-胡萝卜素(β-CE)是维生素A的前体,具有多种生物活性功能[5]。国内外大量研究表明:β-CE具有抗癌和作为天然抗氧化剂的作用,而且还可以作为天然色素应用于饮料加工中[6]。然而,β-CE在食品工业中的应用有较大的局限性,主要是由于β-CE对光、热、氧等条件十分敏感,极其不稳定,容易降解,另外,β-CE的水溶性差[7]。β-CE与CN在体外通过自组装作用形成β-CE/CN纳米复合物,对β-CE起到了保护的作用,而且CN在胃肠中易于消化吸收,因此为β-CE的释放和提高生物利用率创造了条件[8]。

本研究以酪蛋白酸钠为原料,通过β-CE与CN混合,形成β-CE/CN纳米复合物,并测定影响β-CE/CN纳米复合物形成的因素,β-CE/CN纳米复合物的粒径分布以及β-CE/CN纳米复合物的生物利用率。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

β-胡萝卜素SIGMA公司，酪蛋白酸钠蒙牛乳业，丙酮天津科密欧化学试剂厂，氯化钙天津博迪化工有限公司，磷酸氢二钾天津博迪化工有限公司，柠檬酸三钠天津致远化学有限公司，胰蛋白酶SIGMA公司，胃蛋白酶SIGMA公司，十二烷基硫酸钠天津博迪化工有限公司，过硫酸铵天津博迪化工有限公司，甲醇天津科密欧化学试剂厂，冰乙酸天津科密欧化学试剂厂，考马斯亮蓝南京奥多福尼生物公司。

pH计sartorius，电子天平上海越平科学仪器有限公司，HWS24型恒温水浴锅上海一恒科技有限公司，F-2700型荧光分光光度计HITACHI，激光粒度分析仪 Malvern公司，DYY-8C型凝胶电泳仪北京六一仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1β-CE/CN纳米复合物的制备18 mL 0.3 mmol/L的β-胡萝卜素丙酮溶液经过0.45 μm滤膜过滤,并与4 mL 1 mol/L柠檬酸三钠共同加入到200 mL 5%的酪蛋白酸钠溶液中,然后将24 mL 0.2 mol/L的K2HPO4和20 mL 0.2 mol/L的CaCl2分8次加入上述溶液中,每次间隔15 min,在加入过程中,溶液在37 ℃水浴锅中边搅拌边加入,加完后将溶液pH调至6.7,最后用蒸馏水将上述溶液定容到400 mL,将pH重新调至6.7,轻轻搅拌1h,通过CN的自组装得到β-CE/CN纳米复合物[9]。

1.2.2β-CE/CN纳米复合物荧光强度测定

1.2.2.1温度对β-CE/CN纳米复合物的影响在温度分别为28、32、36、40、44、48 ℃,β-CE与CN质量比为1∶300,pH6.7的情况下,按1.2.1的方法分别对β-CE进行自组装,使用荧光分光光度计测定相对荧光强度来表示自组装分子在不同温度环境中的最佳组装条件,其中激发波长为301 nm,发射波长为409 nm。

1.2.2.2β-CE与CN质量比对β-CE/CN纳米复合物的影响在β-CE与CN质量比分别为1∶200、1∶250、1∶300、1∶350、1∶400、1∶450,在温度40 ℃,pH6.7的情况下,按1.2.1的方法分别对β-CE进行自组装,使用荧光分光光度计测定相对荧光强度来表示自组装分子在不同温度环境中的最佳组装条件。

1.2.2.3pH对β-CE/CN纳米复合物的影响在pH分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4,β-CE与CN质量比为1∶300,pH6.7的情况下,分别进行自组装,使用荧光分光光度计测定相对荧光强度来表示自组装分子在不同温度环境中的最佳组装条件。

1.2.4β-CE/CN纳米复合物的生物利用率

1.2.4.1胰蛋白酶酶解产物的SDS-PAGE分析将β-CE/CN纳米复合物中加入2 g胰蛋白酶,调pH至胰蛋白酶活性位点,37 ℃水浴条件下搅拌,分别在酶解0、30、60、90、120 min时取样并分别用HCl终止反应,将5个时间段所取样品进行SDS-PAGE。

胰蛋白酶解产物采用SDS-PAGE进行分析,分离胶浓度为15%,浓缩胶浓度为5%,酶解产物用上样缓冲液稀释后取10 μL点样于进样孔,电泳槽运行电压稳定在120 V,分离的蛋白用考马斯亮兰进行染色1h,然后用脱色液(冰乙酸∶甲醇∶水=7.5∶7.5∶85,v∶v∶v)进行脱色,最后经凝胶成像处理,水解产物分子量的确定通过与标准蛋白的分子量进行比较。

1.2.4.2胃蛋白酶酶解产物的SDS-PAGE分析将β-CE/CN纳米复合物中加入0.5 g胃蛋白酶,调pH至胃蛋白酶活性位点,37 ℃水浴条件下搅拌,分别在酶解0、30、60、90、120 min时取样并分别用NaOH终止反应,将5个时间段所取样品进行SDS-PAGE,其条件同胰蛋白酶解产物的SDS-PAGE分析。

2　结果与分析

2.1β-CE/CN纳米复合物荧光强度测定结果分析

研究表明,酪蛋白与脂溶性分子β-CE相结合会使β-CE荧光基团发生淬灭,因此利用荧光分光光度计测得的β-CE/CN纳米复合物自组装分子的相对荧光强度会低于正常浓度的β-CE的相对荧光强度。根据相对荧光强度的大小能够表现出酪蛋白与子β-CE的结合强度[7]。

图1～图3分别为温度、β-CE与CN质量比与pH对β-CE/CN纳米复合物影响的荧光强度结果图。图1中,当自组装温度在28～40 ℃范围内,其荧光强度变化不大,因此温度在此范围内对β-CE/CN纳米复合物的结合强度影响较小,而当温度为44、48 ℃时,其荧光强度显著增大。由此可知,温度超过40 ℃时,β-CE/CN纳米复合物的结合强度显著降低;从图2中可以看出,当β-CE与CN质量比为1∶300时,其荧光强度最小,β-CE/CN纳米复合物结合强度最大,当β-CE与CN质量比为1∶200与1∶250时,β-CE/CN纳米复合物结合强度略低于质量比为1∶300时的结合强度,但差异并不显著,而当β-CE与CN质量比大于1∶300时,β-CE/CN纳米复合物结合强度显著降低(p<0.05),质量比超过1∶400时结合强度的变化趋于稳定;由图3可知,pH在6.4～7.4的范围内,β-CE/CN纳米复合物的荧光强度值基本趋于稳定,在pH为7时其荧光强度稍有降低,但差异并不显著,因此可知,pH对β-CE/CN纳米复合物的结合强度的影响不大。

图1　温度对β-CE/CN纳米复合物影响的荧光强度Fig.1　Effect of temperature on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

图2　β-CE与CN质量比 对β-CE/CN纳米复合物影响的荧光强度Fig.2　Effect of ratio of β-CE to CN on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

图3　pH对β-CE/CN纳米复合物影响的荧光强度Fig.3　Effect of pH on fluorescence intensity from β-CE/CN nanoparticle complex

2.2β-CE/CN纳米复合物粒径测定结果分析

图4是β-CE/CN纳米复合物及对照组的粒径分布情况,由图4可以看出,β-CE/CN纳米复合物的平均粒径为18.53 nm,酪蛋白酸钠的平均直径为47.63 nm，经自组装的β-CE/CN纳米复合物的平均粒径与对照组酪蛋白的平均粒径相比显著减小。该结果说明β-CE经酪蛋白自组装以后,酪蛋白与β-CE结合以后,其β-CE能更好的分散于水溶液中,提高了其水溶解度。

图4　β-CE/CN纳米复合物与对照组酪蛋白粒径分布Fig.4　Particle size distribution of β-CE/CN nanoparticle complex and casein

2.3β-CE/CN纳米复合物中β-CE的生物利用率

图5　胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解β-CE/CN 纳米复合物产物的SDS-PAGEFig.5　SDS-PAGE of enzymatic hydrolysis product from β-CE/CN nanoparticle complex by trypsin and pepsin

为了分析β-CE/CN纳米复合物中β-CE的生物利用率,本实验通过体外模拟肠道中胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解β-CE/CN纳米复合物,以酪蛋白的降解来分析β-CE的释放。

图5A为胰蛋白酶酶解β-CE/CN纳米复合物产物的SDS-PAGE图,从该图可以看出,随着酶解时间的延长,分子量范围为25.0～35.0 ku的酪蛋白在SDS-PAGE中条带的密度逐渐降低,说明了酪蛋白的降解增大,说明了β-CE从β-CE/CN纳米复合物中释放率增加。

图5B为胃蛋白酶酶解β-CE/CN纳米复合物产物的SDS-PAGE图,从该图可以看出,胃蛋白酶解以后,其酪蛋白条带几乎消失,而在酪蛋白条带的下面,出现了很多条带,说明了酪蛋白经胃蛋白酶解以后,产物中出现了更多的小分子量蛋白和肽。随着胃蛋白酶酶解时间的延长,小分子量蛋白的密度降低,说明产物中有更多的小分子量蛋白和肽,随着蛋白的不断酶解,β-CE也会逐渐释放出来。

3　结论

在特定的条件下,β-胡萝卜素与酪蛋白能够形成β-CE/CN纳米复合物,实验中分别测定了不同温度、β-CE与CN质量比、pH对β-CE/CN纳米复合物形成的影响,温度高于40 ℃与β-CE与CN质量比大于1∶300时不利于β-CE/CN纳米复合物的形成,而pH对β-CE/CN纳米复合物的形成没有显著的影响。β-CE/CN纳米复合物的平均粒径小于酪蛋白,说明β-CE经酪蛋白自组装后,提高了β-CE的水溶性。体外模拟胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解作用的结果显示,随着酶解时间的延长,酪蛋白被酶解的量增加,表明β-CE从β-CE/CN纳米复合物中会更多的释放出来,提高了β-CE的生物利用率。

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Formation ofβ-CE/CN nanoparticle complex and bioavailability ofβ-CE

ZHANG Yi-xin,HE Sheng-hua*,TANG Hai-shan,MA Ying

(College of Food Science & Engineering,Harbin Institute of Technology of China,Harbin 150090,China)

β-carotene(β-CE)has various biological activities,but it is unstable and easily degradation.β-carotene self-assembles in casein(CN)and form nanoparticle complex,with plays an important role in protectingβ-carotene. Thereby,β-carotene/CN nanoparticle complex can enhances the utilization value ofβ-carotene in the food industry. The paper was based on the formation ofβ-CE/CN nanoparticle complex,and the influence factors,such as formation,the particle size distribution and bioavailability ofβ-CE were investigated. The results showed that temperature andβ-CE/CN mass ratio had great impact on its formation,β-CE re-assembled in CN can improve water solubility ofβ-CE. After digestion experimentinvitro,β-CE was hydrolyzed by trypsin and pepsin,the hydrolysis degree of casein was increased with the increase of hydrolysis time. Therefore,β-CE easily released fromβ-CE/CN nanoparticle complex and its bioavailability was enhanced.

β-carotene;casein;nanoparticle complex;bioavailability

2015-05-19

张怡欣(1991-),女,硕士研究生,研究方向:乳品化学与乳品加工技术,E-mail:zyxkysmile@163.com。

何胜华(1974-)，男,博士,讲师,研究方向:乳品化学与乳品加工技术,E-mail:heshenghua@hit.edu.cn。

中国博士后特别资助(2014T70360)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)05-0068-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.005