甲状腺功能减退症大鼠卵巢TSHR表达及与TNF-α、IL-6的关系

周换丽，孙　燕，邓大同，王佑民

甲状腺功能减退症大鼠卵巢TSHR表达及与TNF-α、IL-6的关系

周换丽，孙燕，邓大同，王佑民

目的 探讨甲状腺功能减退大鼠体内肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及促黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌激素（E）、孕激素（P）水平变化，并检测大鼠卵巢中促甲状腺激素受体（TSHR）的表达，了解TSHR是否与TNF-α和IL-6细胞因子的变化存在关联。方法 10只雌性SD大鼠分为2组，正常组（n=5）及甲减组（n=5），正常组饮用自来水，甲减组饮用0.05%丙硫氧嘧啶（PTU）水诱导成年期甲状腺功能减退大鼠模型。8周后采用ELISA法测定大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、促甲状腺激素（TSH）水平及各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P水平，并通过免疫组化检测卵巢TSHR的表达。结果 ①与正常组比较，甲减组TNF-α、IL-6升高（P＜0.01）；②与正常组比较，甲减组LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）；③甲减组大鼠卵巢原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡中TSHR表达强度较正常组差异无统计学意义。甲减组大鼠卵巢黄体组织中TSHR表达强度高于正常组（P＜0.05）；④TNF-α、IL-6与黄体中TSHR有线性正相关性（P＜0.05）。结论 TSHR在甲状腺功能减退大鼠卵巢黄体中表达增强，可能与炎性因子TNF-α、IL-6存在关联。

甲状腺功能减退；卵巢；TNF-α；IL-6

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.012.html

内分泌系统与免疫系统之间有着双向作用，内分泌系统通过合成和释放特殊激素，调节免疫细胞的功能，而与此同时，免疫系统可通过释放细胞因子，调节内分泌系统［1］。促甲状腺激素受体（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）作为促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受体，已被证实不仅仅存在于甲状腺组织，在牛、大鼠卵巢以及人子宫内膜和卵巢中都发现活性TSHR的存在［2-5］，证实TSHR在生殖调节中扮演着重要的角色。研究［6-7］表明，甲状腺功能减退可以引起肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）细胞因子水平的变化。TSHR作为激素受体，在甲状腺功能减退大鼠卵巢内是否发生变化，是否与TNF-α、IL-6有关联，两者关联是否是甲状腺功能减退导致不良妊娠结局的又一机制，值得探讨。该实验通过建立甲状腺功能减退大鼠模型，测定大鼠体内TNF-α、IL-6及相关黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌激素（estrogen，E）、孕激素（progestin，P），并通过检测甲状腺功能减退大鼠卵巢TSHR的表达，初步探讨TSHR在甲状腺功能减退大鼠卵巢中的表达及其是否与TNF-α、IL-6细胞因子的变化有关，为甲状腺功能减退通过免疫系统在卵巢水平影响生殖系统功能提供新的探索思路。

1　材料与方法

1.1实验动物 SPF级6周龄SD雌性大鼠10只，购自安徽医科大学动物实验中心；于安徽医科大学动物饲养中心喂养，每笼5只，温度（22±2）℃，昼夜循环，所有动物自由进食、饮水。实验过程遵循安徽医科大学实验用动物管理和使用指南。

1.2试剂与仪器 主要试剂：丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）（美国 Sigma公司）；三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲状腺素（thyroxin，T4）、促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P ELISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司）；TSHR抗体：兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。主要仪器：酶标仪RT-6000（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；离心机JW3021HR（安徽嘉文仪器装备有限公司）；电热恒温箱DNP-9052BS-Ⅲ（上海三发科学仪器有限公司）；-80℃冰箱（合肥美菱股份有限公司）；OLYMPUSBX53显微镜（日本Olympus公司）。

1.3动物模型设计 10只SD雌性大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组，正常组（n=5）及甲减组（n=5），正常组饮用自来水，甲减组饮用0.05% PTU水，共8周［8］。后采用阴道分泌物涂片法根据细胞的变化特点判断大鼠发情周期，大鼠发情周期为4～5 d，避开大鼠发情前期及发情期，于大鼠发情后期及发情间期取材。

1.4标本制备 血清：水合氯醛0.3 ml/100 g体重，腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心20 min后取血清置于-80℃冰箱保存待测T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P。卵巢组织：腹腔麻醉后，打开大鼠腹腔，沿着大鼠Y型子宫，找到位于输卵管两端的卵巢，用生理盐水冲洗后，放置于中性福尔马林液固定，包埋后，送至病理科，连续4μm石蜡切片。

1.5甲状腺激素测定 大鼠血清T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P通过ELISA法测定，具体按试剂盒说明书操作。

1.6TSHR的检测 采用免疫组化SP法操作：①烤片，60℃、2 h；②常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、100%酒精5 min、95% 酒精5min、75%酒精5min；③抗原修复：置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中，煮沸后，高压修复1 min 40 s，自然冷却30 min以上，再用冷水冲洗，PBS冲洗3次，每次3 min；④阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；⑤正常羊血清工作液封闭，37℃、10 min，倾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；⑧DAB反应染色，自来水充分冲洗后，苏木精复染、蓝化、常规脱水、透明、干燥、封片。在光学显微镜观察拍照，放大倍数400，所有摄片在同等参数下进行，采用Image-Pro plus 6.0系统测平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.7统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析，正态分布计量资料数据以¯x±s描述，两组间均数比较用t检验；TNF-α、IL-6与TSHR的相关关系采用线性相关分析，进一步采用多元逐步回归分析判断相关因素显著性。

2　结果

2.1两组甲状腺功能水平 PTU饮用水诱导雌性大鼠8周后，PTU诱导组大鼠出现行动缓慢、毛色发黄、脱毛等现象，且两组大鼠血清结果显示，与正常组比较，甲减组T3、T4明显降低（P＜0.01），TSH升高（P＜0.05），甲状腺功能减退模型造模成功。见表1。

表1　两组甲状腺功能水平比较

表1　两组甲状腺功能水平比较

与正常组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

项目甲减组（n=5）　正常组（n=5）　t值　P值T3（ng/ml）　68.50±7.24**82.27±3.44　-3.842　0.005 T4（μg/L）　118.45±16.79**　151.56±10.19　-3.769　0.005 TSH（μIU/L） 1 363.50±221.41*1 086.00±100.39　2.552　0.034

2.2两组TNF-α、IL-6及性激素水平比较 与正常组比较，甲减组TNF-α、IL-6水平显著升高（P＜0.01）。LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）。

表2　两组TNF-α、IL-6及性激素水平比较（x¯±s）

表2　两组TNF-α、IL-6及性激素水平比较（x¯±s）

与正常组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

项目甲减组（n=5）　正常组（n=5）　t值　P值TNF-α（ng/ml）254.060±50.440**140.650±30.550　4.300　0.003 IL-6（ng/ml）　182.260±10.010**146.360±8.600　6.080　0.000 LH（ng/L）　20.001±2.759*　15.288±1.791　3.204　0.013 FSH（IU/L）　11.449±2.298*　7.134±0.790　4.017　0.010 E（ng/L）　22.119±1.846**　33.182±5.640　-4.166　0.003 P（pmol/L）　566.990±89.946*733.150±92.412-2.881　0.020

2.3两组卵巢TSHR表达水平 正常组大鼠卵巢组织中，TSHR表达在卵巢上皮细胞胞质（图1A1）、原始卵泡的卵母细胞（图1B1）、初级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞（图1C1）、次级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞（图1D1）、黄体颗粒细胞（图1E1）中；甲减组大鼠TSHR表达部位差异无统计学意义，卵巢上皮细胞胞质（图1A2）、原始卵泡的卵母细胞（图1B2）、初级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞（图1C2）、次级卵泡的颗粒细胞及卵母细胞（图1D2）、黄体颗粒细胞（图1E2）。甲减组TSHR表达在原始卵泡，初级卵泡及次级卵泡中表达差异无统计学意义，在黄体细胞中表达强度高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

图1　正常大鼠及甲状腺功能减退大鼠卵巢组织　TSHR的表达 SP×400A：大鼠卵巢上皮细胞；B：原始卵泡（箭头所指为原始卵泡）；C：初级卵泡（箭头所指为初级卵泡）；D：次级卵泡；E：黄体；1：正常组；2：甲减组

表3　两组卵巢组织原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和黄体　TSHR表达强度比较

表3　两组卵巢组织原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和黄体　TSHR表达强度比较

与正常组比较：*P＜0.05

项目甲减组正常组　t值P值原始卵泡0.002 2±0.000 70　0.001 5±0.000 48　-1.612　0.146初级卵泡　0.018 5±0.008 58　0.009 2±0.006 57　-1.493　0.210次级卵泡　0.048 1±0.012 09　0.085 5±0.003 55　2.031　0.060黄体细胞　0.104 9±0.012 82*0.090 0±0.006 15　2.346　0.047

2.4TNF-α、IL-6与黄体组织TSHR的关系TNF-α与TSHR呈正线性相关性，差异有统计学意义（r=0.841，P＜0.01）；IL-6也与 TSHR呈正线性相关性，差异有统计学意义（r=0.648，P＜0.05）。进一步采用多元逐步回归，分析可能对TSHR（Y）表达有影响的因素TNF-α（X1）、IL-6（X2）、T3（X3）、T4（X4）、TSH（X5）、FSH（X6）、LH（X7）、E（X8）、P（X9），其中X为参与多元回归的自变量，P为多元复相关显著性，R为复相关系数，β为标准偏回归系数。建立回归方程：Y=0.069+0.000X1，TNF-α与TSHR有显著相关性（P＜0.05，R=0.841，β= 0.841）。

3　讨论

内分泌器官通过分泌特定激素，参与生殖调控。下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺以及卵巢功能的失常可以导致女性生殖系统调控的紊乱［9］。甲状腺功能减退是生育期妇女常见的内分泌疾病，可以导致不孕、流产、早产、胎儿生长发育受限和低体重儿等不良妊娠结局［10-11］。探讨甲状腺功能减退影响生殖器官功能的机制对于临床更好地防治不良妊娠的发生有着重要意义。

甲状腺功能减退影响下丘脑-垂体-卵巢轴的功能，涉及的机制有：甲状腺激素分泌减少，反馈抑制促甲状腺激素释放激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）分泌的作用降低，随着TRH分泌增加，促使泌乳素、FSH以及黄体生成素（luteinizing hormone，LH）分泌增加，从而导致卵巢调节功能紊乱［12］。TSHR作为TSH受体，同卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）及黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）同属于G蛋白偶联受体超家族，能够被异源二聚体糖蛋白激素（TSH、FSH、LH、HCG）激动，这些异源二聚体糖蛋白激素有相同的GPA1亚基，与不同的β亚基（分别为TSHβ、FSHβ、LHβ、CGβ）结合后形成不同的糖激素蛋白，发挥不同的生理作用［13］。

研究［13］显示，一种新的异源二聚体糖蛋白激素thyrostimulin成为G蛋白偶联受体超家族中的一员，能够与TSHR结合，在体内外发挥作用。TSHR不仅仅存在于甲状腺组织中，高亲和力的TSH结合位点以及TSHR转录还存在于淋巴细胞、棕色脂肪组织以及红细胞，证实TSHR在免疫、产热及局部血液循环调控中扮演着重要角色。在非成熟SD大鼠卵巢组织内，卵母细胞表达thyrostimulin，颗粒细胞表达TSHR，两者构成旁分泌内环境，thyrostimulin与TSHR结合后使得细胞内cAMP含量及c-fos蛋白含量增加，进而调控细胞的生长、发育和分化。该作用被促性腺激素加强，促性腺激素通过增加细胞内cAMP的含量，使得TSHR表达增加。而雌激素作用相反，使得 TSHR表达下降［3］。

本研究显示，甲减组大鼠体内FSH、LH水平增加，E、P水平降低，而卵巢黄体组织中TSHR的表达较正常组强，推测机制可能为：①甲状腺功能减退使得体内FSH及LH增加，促性腺激素水平增加，通过激活cAMP，增加TSHR的表达；②甲状腺功能减退，体内肝脏合成性激素结合蛋白下降，降低体内雌激素水平，导致TSHR表达增加。卵巢组织中黄体细胞的形成及退化的调控机制十分复杂，不仅仅通过激素调控，且免疫系统包括淋巴细胞、吞噬细胞、单核细胞、中性粒细胞及细胞因子TNF-α及IL-6在此发挥重要作用。

研究［14］显示，在牛的整个性周期中TNF存在于黄体，尤其在黄体衰退时期表达和分泌增加。TNF-α不仅由黄体细胞合成，还由巨噬细胞和T淋巴细胞分泌。TNF-α受体表达于类固醇合成细胞及内皮细胞。类固醇合成细胞，内皮细胞及T淋巴细胞之间的相互作用在黄体溶解中扮演重要角色。而用IL-4、IL-5、IL-6等处理黄体颗粒细胞，发现使得皮质酮转化为皮质醇的1型11羟类固醇脱氢酶（11-β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1，11β-HSD）活性增加，功能性黄体中1型11β-HSD活性增强，增加了黄体内在皮质醇的含量，抑制了局部免疫细胞的功能，进而影响了免疫细胞在黄体形成及退化中的作用。

研究［15］表明，甲状腺功能减退大鼠体内TNF-α、IL-6等细胞因子水平升高。进而设想，甲状腺功能减退是否通过改变体内细胞因子水平从而影响卵巢组织内细胞的生长、发育和分化，该作用是否与卵巢组织中TSHR表达异常关联？本研究结果提示，在甲状腺功能减退大鼠体内TNF-α，IL-6水平增加，与研究［15］结果一致。甲状腺功能减退大鼠卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡中TSHR表达与正常组差异无统计学意义，但黄体组织中TSHR的表达较正常组强，TNF-α及IL-6水平升高与TSHR表达增加一致，TNF-α与TSHR显著正相关性。表明甲状腺功能减退可能通过影响免疫系统及卵巢黄体组织中TSHR表达，进而影响生殖系统功能。但两者间关联的具体机制尚需进一步研究。

综上所述，在甲状腺功能减退状态下，体内炎性细胞因子表达水平增加，TSHR在黄体中表达增加，两者可能导致卵巢组织中局部免疫环境改变，影响生殖系统功能。

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The TSHR expression on ovary in hypothyroid rats and their relationship w ith TNF-αand IL-6

Zhou Huanli，Sun Yan，Deng Datong，et al
（Dept of Endocrinology，Institute of Endocrinology and Metabolism，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To detect the TNF-α，IL-6 and sex hormones in hypothyroid rats，throughmeasuring the expression of thyroid-stimulating hormone receptor（TSHR）in ovary of hypothyroid rats to know if TSHR has relationship with TNF-αand IL-6.Methods 10 ratswere divided into 2 groups，the control group（n=5）which ratswere fed with normalwater and hypothyroid group（n=5）which were fed with 0.05%propyl thiouracil（PTU）in drinking water.After 8 weeks，the levels of serum TNF-αand IL-6 of each group weremeasured aswell as the immunohistochemical expression of TSHR on the ovary.Results ①The hypothyroid group had the higher levels of TNF-α，IL-6（P＜0.01）compared to the control group；②The hypothyroid group had the higher levels of LH，FSH（P＜0.05）and lower E，P（P＜0.05）compared to the control group；③The expression of TSHR in primordial follicles，primary follicles and secondary follicles in hypothyroid group presented no statistical significance compared to the control group while the level of TSHR in corpus luteum in hypothyroid group was higher than that in the control group（P＜0.05）；④TNF-αand IL-6 had positive linear correlation with TSHR expressed in corpus luteum（P＜0.05）.Conclusion The high expression of TSHR on corpus luteum of ovarymay has relationship with TNF-αand IL-6.

hypothyroid；ovary；TNF-α；IL-6

R 581.2；R 339.221

A

1000-1492（2016）05-0633-05

2016-01-18接收

公益性行业专项基金项目（编号：201402005）；安徽省自然科学基金项目（编号：1608085MH207）

安徽医科大学第一附属医院内分泌科、安徽省内分泌代谢

病省级实验室，合肥 230022

周换丽，女，硕士研究生；

王佑民，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：youminwang@21cn.com