PICK1对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

谢　娟，周　群，刘雪姣，黄　成，孟 晓明，李 俊

PICK1对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

谢娟1，2，3，周群1，2，3，刘雪姣1，2，3，黄成1，2，3，孟 晓明1，2，3，李 俊1，2，3

目的 检测蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（PICKl）在肝癌、癌旁组织中的表达，初步探讨PICK1对人肝癌细胞HepG2增殖的作用及其可能机制。方法 应用qRT-PCR、Western blot、HE和免疫组织化学染色法分析比较人肝癌和癌旁组织中PICK1蛋白的表达；培养HepG2细胞，体外给予不同浓度的FSC-231（PICKl的PDZ结构域小分子抑制剂），通过MTT法检测HepG2细胞的活力；采用流式细胞术检测HepG2细胞周期变化；进一步采用Western blot法检测G1/ S-特异性周期蛋白-D1（CyclinD1）、原癌基因C-myc和Notch信号通路蛋白表达。结果 肝脏病理组织学检测提示肝癌组织病变明显。免疫组化结果显示，肝癌组织中相比癌旁组织中的PICKl抗原阳性细胞显著增多（P＜0.05），且多分布在肝实质细胞质区域；qRT-PCR和Western blot结果显示肝癌组织中PICK1 mRNA及蛋白水平与癌旁组相比显著升高（P＜0.05）；体外实验证明，与阴性对照组相比，FSC-231能够抑制HepG2细胞的增殖，并且明显抑制CyclinD1、C-myc和Notch1同源蛋白1（Notch1）、Hes-1蛋白表达（P＜0.05）。结论 提示PICK1可能参与肝癌的发生发展，PICK1的PDZ结构域抑制剂可以抑制肝癌细胞的增殖，此作用可能与Notch信号通路相关。

PICK1；FSC-231；HepG2细胞；肝癌；肝细胞增殖；CyclinD1；Notch-1；Hes-1

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.004.html

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是死亡率居于世界第二的常见恶性肿瘤，近年来中国的肝癌发生率逐年上升［1］。肝癌的发生、发展受多种因素影响，其具体机制尚未清楚。蛋白激酶Cα相互作用蛋白1（protein interactingwith Cαkinase 1，PICKl）广泛分布于机体的组织细胞内，由卷曲螺旋区、酸性氨恶酸区、PDZ结构域和BAR结构域组成，其PDZ与BAR结构域能够募集包括肿瘤相关蛋白在内的多种功能蛋白质并调节其趋向定位，广泛参与多种恶性肿瘤的发生发展［2-4］。然而目前尚无相关PICK1在肝癌中的表达情况及病理机制的文献报道。该研究拟应用PICKl的PDZ结构域小分子抑制剂FSC-231观察 PICK1对人肝癌细胞 HepG2细胞的增殖以及G1/S-特异性周期蛋白-D1（G1/S-specific cyclin-D1，CyclinD1）、原癌基因 C-myc和Notch1同源蛋白1（Notch homolog 1，Notch1）、Hes-1蛋白表达变化的影响，初步探讨PICKl在肝癌中的作用以及其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1肝癌组织 肝癌组织和癌旁组织由安徽医科大学第一附属医院普外科提供。

1.1.2细胞株 人肝癌细胞HepG2由安徽医科大学第一附属医院药剂科提供。

1.1.3主要材料与试剂 FSC-231购于德国Merck集团有限公司，分子量313.14，货号CAT52953；PICK1抗体购于美国Abcam公司；CyclinD1、C-myc、Notch-1、Hes-1抗体购于美国Cell Signaling公司；βactin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；一抗稀释液购于上海碧云天生物技术有限公司；二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；RIPA裂解液购于上海信则生物科技有限公司；PVDF膜购于北京索莱宝科技有限公司；显影液购于北京信力益达商贸有限公司；噻唑蓝 MTT和碘化丙锭（PI）购于美国Sigma公司；培养基购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；TRIzol Reagent RNA提取试剂购于美国Invitrogen Life Technologies公司；SYBR Green逆转录试剂盒均购于宝生物工程（大连）有限公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4仪器与设备 Napco-6100型细胞培养箱（美国杜邦公司）；多功能显微镜、倒置相差生物显微镜（日本OLYMPU公司）；酶标仪MK3（荷兰雷勃公司）；Eppendorf Centrifuge 5415R冷冻离心机、Mastercycle epgradient Eppendorf PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Bio-RAD Power Pac Basic电泳仪；电子天平FA2004A（上海精天电子仪器厂）；流式细胞仪（美国Beckman有限公司）。

1.2方法

1.2.1HE染色和免疫组织化学染色 将肝组织经4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，用苏木精-伊红染色制成玻片。采用SP法染色常规脱蜡后用过氧化酶阻断溶液，室温孵育15 min；PBS冲洗后加0.1%的胰蛋白酶消化20 min，置于非免疫性动物血清中室温孵育10min；一抗4℃孵育过夜，用PBS清洗后加生物素标记的二抗，室温下孵育30 min；用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液孵育，30 min后用DBA显色、苏木精复染、封片观察。最后将玻片置于倒置显微镜下观察实验结果。

1.2.2HepG2细胞的培养和传代 用含10%胎牛血清的 DMEM培养液，在37℃5%CO2及饱和湿度条件下培养，细胞为贴壁生长，每2～3 d用胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3细胞增殖实验 取对数生长期的HepG2细胞，以5 000/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔加入200μl细胞悬液铺板。细胞贴壁后，用含不同浓度FSC-231（0、5、25、50、100、200μmol/L）的培养基继续培养细胞。分别培养24、48、72 h后弃去原培养液，每孔加入180μl无血清培养基和20μl（5 mg/ml）MTT贮存液继续培养，4 h后加入150μl DMSO，振荡10 min，待结晶充分溶解后，置摇床低速振荡10 min，使结晶充分溶解，在492 nm处用酶标仪检测每孔的光密度（optical density，OD）值。按公式计算FSC-231对HepG2的生长抑制率，生长抑制率（%）=（1-OD给药组/OD对照组）×100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期 将HepG2细胞以4×105接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，用含不同浓度FSC-231（0、5、25、50μmol/L）培养基继续培养24 h后收集细胞用胰蛋白酶消化重悬，1 200 r/min低速离心5 min后用PBS洗2次，收集细胞沉淀于75%冰乙醇中固定，12 h后3 000 r/min离心5 min，去上清液，PBS洗1次，加入PI染液，室温下染色30 min后样品4℃避光保存，最后应用流式细胞仪进行检测，用软件计算细胞周期各时相DNA的百分含量。

1.2.5肝脏组织总RNA提取和RT-PCR 取肝癌及癌旁组织各30 mg于1 ml TRIzol中，充分剪碎研磨，提取总RNA。根据逆转录酶说明书将总RNA逆转录成cDNA，按照荧光定量染料SYBR Green试剂盒说明书制备反应混合体系，设置反应条件，采用β-actin作为本实验的内参，上机检测。本实验所需引物序列如下：PICK1（F：5′-CCTGCCTCTATATCG TCCAGGTA-3′；R：5′-ATCGCCAGCTGCTGCCACTGT-3′），β-actin（F：5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′；R：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′）。

1.2.6Western blot检测肝脏组织中PICK1蛋白表达变化和HepG2细胞中CyclinD1、C-myc、Notch1蛋白的表达 取肝癌及癌旁组织各50 mg于1 ml裂解液（含10μl PMSF）中，置于冰上裂解30 min后4℃，12 000 r/min离心 30 min，取上清液加入蛋白上样缓冲液，100℃加热10 min使蛋白变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；取对数期生长的HepG2细胞消化后接种于培养瓶中，每孔细胞数约为2× 105个，待细胞贴壁后，用含不同浓度（0、5、25、50 μmol/L）PICK1抑制剂FSC-231的培养基继续培养，24 h后收集细胞，提取细胞。每组加1 ml裂解液（含10μl，PMSF），同上步骤处理提取的细胞蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后用BioRAD湿转仪器将蛋白转到膜上，电流200 mA，用5%脱脂奶粉封闭膜4 h后用TBST清洗，与1∶500一抗4℃孵育过夜，一抗浓度为：CyclinD1（1∶500）、C-myc（1∶500）、PICK1（1∶500），洗膜，每次10 min，共洗4次，再与1∶1 000的与一抗种属相匹配的二抗室温孵育1 h，再用TBST清洗膜3次，每次10 min，用ECL发光试剂盒显影，扫描成像结果用Image J软件分析，以β-actin为内参。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据用 ¯x±s表示；One-Way ANOVA法检验各组间差异。所有实验重复3次。

2　结果

2.1人肝脏组织病理学检测 肝癌癌旁组织中肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，未见病理性改变；肝癌组织肝小叶结构被严重破坏，肝细胞胞核增大且不规则并伴有大量脂肪空泡；免疫组织化学染色结果显示，肝癌组织中PICK1蛋白主要表达在肝癌细胞质内，呈强阳性，而癌旁组织中PICK1蛋白表达量相对较低。见图1。

2.2人肝癌组织中PICK1的m RNA和蛋白表达水平 RT-PCR及Western blot结果显示，与肝癌癌旁组织相比，肝癌组织中的PICKlmRNA相对表达量显著增高8倍，蛋白相对表达量显著增高3倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1　PICK1在不同肝脏组织中的表达 SP×200A：癌旁组织；B：肝癌组织；1：HE染色；2：免疫组织化学染色

图2　PICK 1在不同肝脏组织中的　mRNA和蛋白表达情况1：癌旁组织；2：肝癌组织；与癌旁组织比较：*P＜0.05

2.3PICK1的PDZ结构域抑制剂FSC-231对HepG2细胞增殖的影响 用含不同浓度FSC-231的培养基培养HepG2细胞。在0～200μmol/L浓度范围内，分别在24、48、72 h测定HepG2细胞生长OD值，计算FSC-231对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制率。MTT法结果显示与0μmol/L FSC-231组相比，FSC-231可呈浓度和时间依赖性地降低HepG2细胞生长OD值，升高细胞增殖抑制率，其中，50μmol/L FSC-231组对细胞的抑制作用较为显著，200μmol/L FSC-231组抑制HepG2细胞增殖的作用最明显。与0μmol/L FSC-231组相比，25～200μmol/L FSC-231组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4PICK1的PDZ结构域抑制剂FSC-231对HepG2细胞周期的影响 用含不同浓度FSC-231的培养基刺激HepG2细胞24 h后，流式细胞术结果表明，与0μmol/L FSC-231组相比，在5～50μmol/ L浓度范围内，50μmol/L FSC-231组的G0/G1期细胞数比例明显升高，G2期细胞数比例明显降低，S期细胞比例受影响较小，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示FSC-231可以影响HepG2细胞在细胞周期G0、G2期的分布。见图3。

2.5PICK1的PDZ结构域抑制剂FSC-231对HepG2细胞中CyclinD1、C-m yc和Notchl、Hes-1蛋白表达的影响 应用PICK1抑制剂FSC-231（5、25、50μmol/L）刺激HepG2细胞后，与0μmol/L FSC-231组相比，50μmol/L FSC-231组的CyclinD1、C-myc以及Notch通路蛋白Notch1、Hes-1的蛋白表达水平呈FSC-231浓度依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

表1　FSC-231对人肝癌细胞　HepG2增殖的抑制率

3　讨论

肝癌的发生发展是由多种因素所致的复杂过程，至今其发病机理尚未清楚，研究［5-7］报道PICKl能够广泛参与乳腺癌、肺癌、肾癌的发生发展，其发挥的促癌作用与PKCα、EphB2、ErbB2/Her-2和TIS21等肿瘤相关蛋白密切相关。PDZ结构域在基因组广泛存在，是多种癌症相关蛋白共同富含的功能 结构域，如AF6、TIS21、PKCα［8-9］。目前已有研究［7］证明PICK1可以通过PDZ结构域与TIS21的C端结合调节NIH 3T3细胞周期变化，与转化生长因子-β1受体（transforming growth factor-β1 receptor，TGF-β1）的C末端结合参与乳腺癌的发生发展［10］。TIS21、Eph、TGF-β1受体均可通过各种途径参与肝癌的发生发展［9，11-12］，然而至今尚无明确的关于PICK在肝癌中作用的研究。本实验采用HE染色验证肝癌组织模型成功，采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色法定性并定量分析了肝癌患者癌旁组织、肝癌组织中PICKl的表达情况。本实验结果显示，与肝癌癌旁组织相比，肝癌组织中PICK1 mRNA和蛋白水平均呈异常高表达，PICK1阳性表达细胞数量及程度显著升高，且主要分布于肝实质细胞的胞浆区域，提示PICK1可能参与肝癌细胞的增殖而影响肝癌的发生、发展。FSC-231是PICKl的PDZ结构域小分子抑制剂，能够通过影响PICK1与其他功能蛋白的结合而发挥不同药理作用［13］。已被反复应用于PICK1疾病机理的研究。体外实验结果进一步证明，PICK1 PDZ结构域小分子抑制剂FSC-231能够抑制人肝癌细胞HepG2细胞的增殖，阻滞HepG2细胞周期由 G1向S期的转变并且明显抑制细胞周期因子CyclinD1、C-myc的蛋白表达水平。

图3　FSC-231对HepG2细胞周期的影响A：0μmol/L FSC-231；B：5μmol/L FSC-231；C：25μmol/L FSC-231；D：50μmol/L FSC-231

图4　FSC-231对　CyclinD1、C-myc和Notch通路蛋白表达的影响

Notch基因是一类高度保守的细胞表面受体，在人体Notch信号通路由Notch1-4受体和Jagged1、Hes-1等多种Notch配体组成，它们影响细胞的分化、凋亡、增殖等过程。有文献［14-15］表明，C端富含PDZ结构域的Notch信号通路蛋白Jagged1、DLL1等能够通过PDZ结构域与Ras-MAPK、Wingless/Wnt等信号通路相互调控促进肝癌发生发展，提示Notch通路蛋白可能通过PDZ结构域参与PICK1对肝癌细胞增殖的调控。本研究显示 PDZ结构域小分子抑制剂FSC-231能够抑制人肝癌细胞HepG2细胞中Notch1、Hes1的蛋白表达水平，其中，50μmol/L浓度组的抑制作用尤为显著。

综上所述，PICKl存在于肝癌病程，其可能参与肝癌细胞增殖的调控，与肝癌发生、发展密切相关，PICK1对肝癌细胞增殖的调控可能与Notch信号通路相关，然而，PICKl在肝癌病程中的具体分子机制尚待进一步研究。

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Function of PICK 1 on proliferation of human HepG2 cells

Xie Juan1，2，3，Zhou Qun1，2，3，Liu Xuejiao1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Institute of Liver Diseases of AnhuiMedical University，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the probably value of PICK1 in HCC patients after hepatectomy and to determine the effects of PICK1 on the proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2.Methods The differential expression of PICK1 in paired tumor and non-tumorous tissue was evaluated by RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry.Exposure HepG2 cellswith different concentrations of FSC-231（a smallmolecule inhibitor of the PICK1 PDZDomain）.MTT assay was used to evaluate the inhibitory rate of proliferation of HepG2.After 24 h treatment of FSC-231 in HepG2 cells，themodulation of FSC-231 on cell cycle distribution of HepG2 cells was detected by flow cytometer，the CyclinD1，C-myc，Notch1，Hes-1 expression of HepG2 cells were examined by RT-PCR and Western blot.Results Compared with paired non-tumorous tissues，PICK1 were highly expressed in HCC tissue，significantly increased mRNA and protein level of PICK1 was observed in HCC tissue（P＜0.05）；FSC-231 was able to effectively inhibit cell proliferation in a concentration and time dependent pattern and significantly decreased the protein levels of CyclinD1，C-myc and Notch1，Hes-1（P＜0.05）.Conclusion PICK1 may be a potential therapeutic target gene for human hepatocellular carcinoma，probably correlating with Notch signal pathway.

PICK1；FSC-231；HepG2 cell；HCC；cell proliferation；CyclinD1；Notch1；Hes-1

R 322.47；R 329.25；R 575；R 965

A

1000-1492（2016）05-0615-05

2016-02-22接收

国家自然科学基金（编号：81473268、81273526）；安徽省科技攻关计划（编号：1301042212）；安徽省自然科学基金项目（编号：1308085MH145）

1安徽医科大学药学院、2安徽医科大学肝病研究所，3安徽省创新药物产业共性研究院，合肥 230032

谢 娟，女，硕士研究生；

李 俊，男，博士，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lijun@ahmu.edu.cn