奥曲肽在蜜蜂毒疼痛模型中的抗伤害感受作用及对背根神经节pCREB表达的影响

唐　珍，欧阳征鹏，王含彦，易　芳，郭冬梅，罗 蓉

奥曲肽在蜜蜂毒疼痛模型中的抗伤害感受作用及对背根神经节pCREB表达的影响

唐珍1*，欧阳征鹏2*，王含彦3*，易芳1，郭冬梅1，罗 蓉3

目的 利用伤害感受敏感型DA大鼠研究奥曲肽（OCT）在蜜蜂毒（BV）疼痛模型中的抗伤害感受作用以及背根神经节（DRG）内磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（pCREB）表达的变化，为生长抑素受体（SSTR）的外周镇痛作用提供理论依据。方法 于DA大鼠右爪足底中间部位，用50μl微量注射器皮下注射BV（0.1mg/50μl）建立BV疼痛模型。成年雄性DA大鼠随机分为5组：对照组、BV组、OCT组、对侧OCT组和环生长抑素（c-SOM）组。分别用秒表和计数器记录大鼠注射BV后抬/舔爪时间和自发性缩足反射次数等伤害感受行为。大鼠机械敏感性阈值用up-down法测定，用50%机械缩爪阈值（PWMT）表示，分别于注射前1 h和注射后1.5 h测量。热刺激反应用热缩爪潜伏期（PWTL）表示，于注射前30 min和注射后2 h测量。采用免疫组织化学方法观察pCREB在DRG表达的变化。结果在DA大鼠足底注射BV后1 h内，OCT组比BV组的抬/舔爪持续时间均缩短（P＜0.05）；OCT组PWMT较BV组升高，但这两组间PWTL差异无统计学意义。注射BV后BV组同侧DRG中pCREB阳性细胞百分数较对照组明显增加（P＜0.05），局部OCT预处理明显减少pCREB阳性细胞百分数（P＜0.05）。结论 足底注射OCT抑制BV导致的自发性伤害感受行为和机械痛敏，并伴有同侧DRG内pCREB表达降低，这一作用可能是OCT通过激活外周局部SSTR导致的。

奥曲肽；蜜蜂毒疼痛模型；背根神经节；pCREB

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.008.html

生长抑素（somatostatin，SST）是广泛分布于中枢和外周神经系统的肽类物质，激活生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）能抑制脊髓背角神经元的活性并导致动物伤害性行为的抑制和人类急慢性疼痛减轻［1］。奥曲肽（octreotide，OCT）是一种人工合成的由8个氨基酸组成的SST类似物。磷酸化cAMP应答元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB）在痛觉信号传递中有重要作用。局部皮下注射角叉菜胶［2］、福尔马林［3］后双侧脑内前扣带回皮质、岛叶皮质、脊髓背角神经元和背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元内CREB磷酸化，并且CREB磷酸化与炎症性疼痛时间一致。DA大鼠是一近交品系大鼠，其典型特点是对机械和热刺激较其他种系大鼠更为敏感［4］。目前国内外尚无关于DA大鼠伤害感受行为学研究的相关报道。该研究利用疼痛敏感型DA大鼠，观察OCT在BV模型中的抗伤害感受效应；并应用BV疼痛模型，用免疫组织化学方法探讨pCREB在BV模型中在DRG表达的变化，初步探讨SSTR镇痛机制，为SST作为局部镇痛剂的临床应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料 75只成年雄性DA大鼠，190～250 g，由瑞典隆德大学引进。大鼠饲养于室温20～25℃环境，12 h光/暗交替循环并给予标准食物。实验遵循国际疼痛研究协会道德伦理要求。von Frey filament购自美国North Coast Medical公司；热刺激仪购自北京硕林苑科技有限公司；冰冻切片机购自德国莱卡公司；自动磨刀机（ZMD-A）购自上海申医教仪器厂；显微照相系统购自日本 Olympus公司；BV、环生长抑素（cyclo-somatostatinc-SOM，c-SOM）及克紫购自美国Sigma公司；OCT购自瑞士Nowartis公司；戊巴比妥钠购自上海山浦化学有限公司；SP免疫组织化学试剂盒及pCREB抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2建立BV模型，观察自发伤害感受行为 于DA大鼠右爪足底中间部位，用50μl微量注射器皮下注射BV（0.1 mg/50μl）产生自发性伤害感受行为。行为学观察指标包括：BV注射后大鼠抬/舔爪持续时间和自发性缩足反射次数以及大鼠的基础机械缩爪阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）、基础热缩爪潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）以及BV注射后2 h的PWMT、PWTL。分别用秒表和计数器记录大鼠注射BV后1 h内抬/舔爪时间和自发性缩足反射次数等伤害感受行为。在每次实验前大鼠先适应环境3 d，行为学测试前大鼠被放测试盒中30 min直到探索和理毛行为消失才开始正式测试。

1.3PWM T的测定 使用up-down法［5-6］及足底触觉测量仪von Frey毛（力度梯度：0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g）。首先使用2.0 g von Frey毛作用于大鼠足底皮肤6～8 s，若产生缩爪反应，则选择其上一力度1.4 g von Frey毛弯曲至同一程度作用于大鼠足底皮肤的同一点，若2.0 g刺激无缩爪反应则选择其下一力度4.0 g刺激，直至发现分别可诱发缩腿及无缩腿的相邻两个刺激强度后，依序继续刺激4次，包括前面的2次，共刺激6次，即可计算50%PWMT。若要求力度超过15.0～0.4 g，则该阈值直接记为15.0 g或0.4 g。50%PWMT（以下简称PWMT）=10 lg（x）+kδ［x为最后刺激力度；k为刺激方式的系数，δ是指各刺激力度（g）相邻间距的平均值，δ=0.17］。

1.4PWTL的测定 分别测定BV注射前30 min和注射后2 h的PWTL，参照文献［7-10］测定，每只动物PWTL测定5次，轮流测定两爪PWTL，5 min作为两爪间隔时间，10 min作为同一爪的间隔时间。第1次测定值弃去，取后4次PWTL的平均值，20 s以上不反应的热刺激确定为20 s。

1.5分组和药物干预及灌注取材 大鼠共分为5组，随机分配：①对照组：右侧足底先注射生理盐水（normal saline，NS）（60μl），10min后同一位点注射NS（50μl）；②BV组：右侧足底先注射NS（60μl），10 min后再注射BV（50μl）；③OCT组：右侧足底先注射OCT（60μl），10 min后再注射BV（50μl）；④对侧OCT组：左侧足底先注射 OCT（60μl），10 min后再右侧足底注射BV（50μl）；⑤c-SOM组：在同侧OCT（60μl）注射前，先注射SSTR拮抗剂c-SOM（60μl），10 min后注射OCT及随后的BV。其中0.1 mg BV冻干粉溶解于50μl无菌 NS中配制成0.1 mg/50μl的BV液，OCT、c-SOM浓度分别为20、128μmol/L。

1.6免疫组织化学 注射BV后30 min在2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后灌注取材按免疫组织化学流程操作，在2%戊巴比妥腹腔注射麻醉（80 mg/kg）后，以12号注射针头从左心室插入升主动脉，用37℃NS 200～300 ml快速灌流冲洗血液，4℃、4%的多聚甲醛400 ml灌流固定后取出注射侧L5 DRG，置于4%的多聚甲醛中后固定24 h，25%蔗糖中脱水至标本沉底，按免疫组织化学操作流程进行后续免疫组织化学实验。包括载玻片预处理、免疫组织化学染色流程及染色后显微照相。抗体染色完成后置于1%的克紫中复染，然后封片计数pCREB阳性细胞百分数。每个大鼠随机取5张切片进行统计学分析。每个实验组5只动物。

1.7统计学处理 采用SigmaStat 2.0软件进行分析，数据用¯x±s表示。对不同处理组的比较采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnett法检验，注射BV前后的PWMT及PWTL的比较采用配对t检验进行分析。

2　结果

2.1OCT对BV导致的自发性伤害感受行为影响

注射BV后DA大鼠产生抬/舔爪和自发性缩足反射，BV组抬/舔爪持续时间和自发性缩足反射次数与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。而注射后1 h内OCT组抬/舔爪持续时间较BV组明显减少（P＜0.05），但自发性缩足反射次数差异无统计学意义。表明OCT抑制了局部注射BV导致的自发性伤害感受行为。对侧OCT组及c-SOM组抬/舔爪持续时间和自发性缩足反射次数与BV组差异无统计学意义。见表1。

表1　局部注射OCT对抬/舔爪和自发性缩足反射的抗伤害感受作用

表1　局部注射OCT对抬/舔爪和自发性缩足反射的抗伤害感受作用

与BV组比较：*P＜0.05

组别抬/舔爪持续时间（s）自发性缩足反射次数（次）对照　6.02±3.21*　7.80±3.33*BV　1 481.35±188.75　95.80±16.22 OCT　947.23±101.96*　101.00±18.12对侧OCT　1 375.50±117.25　92.40±11.90 c-SOM　1 279.21±92.66　95.10±24.21

2.2OCT对PWM T的影响 与BV组比较，局部OCT预处理后PWMT明显升高（P＜0.05），对侧OCT预处理以及 c-SOM组 PWMT均与 BV组差异无统计学意义，表明OCT预处理减轻了DA大鼠因注射BV导致的机械痛敏，SSTR拮抗剂c-SOM拮抗了OCT的效应。见表2。

2.3OCT对PWTL的影响 各组在注射NS前后PWTL差异均无统计学意义。在BV组与OCT组，分别与注射前比较，注射后同侧后爪PWTL明显缩短（P＜0.05），表明足底局部注射BV导致了热痛敏。与对照组再注射后比较，其他4组注射BV后同侧后爪 PWTL均明显降低（P＜0.05），表明局部OCT预处理对热痛敏无效。见表3。

2.4OCT DRG内pCREB表达的影响 pCREB表达于DRG神经元中。在L5 DRG，大多数pCREB存在于ø≤25μm的小神经元中。对照组和BV组同侧L5 DRG的pCREB的阳性细胞表达百分数分别为（16.38±2.51）%和（31.04±3.50）%。与对照组比较，BV组同侧DRG中 pCREB表达的细胞百分数明显增加，局部OCT预处理后pCREB的阳性细胞表达百分数为（17.04±2.44）%，与BV组比较明显减少（P＜0.05）；而对侧OCT组及 c-SOM组 pCREB表达的阳性细胞百分数［（29.25±1.65）%、（26.76±3.52）%］与BV组差异无统计学意义。见图1。

图1　L5 DRG中pCREB的表达 ×200

3　讨论

DA大鼠是一近交品系大鼠，繁殖能力较差，其细胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）2D1/2D2普遍缺乏，这种酶是人类CYP2D6同工酶的同系物［11］，能将可待因通过生物转化成吗啡而起到镇痛效果。研究［3］表明DA大鼠对机械和热刺激较其他种系大鼠更为敏感。

本研究结果表明，足底OCT预处理能降低BV所致的抬爪/舔爪持续时间，但对侧OCT预处理没产生类似的抗伤害感受作用。同侧给予OCT注射之前用SSTR拮抗剂c-SOM预处理，拮抗了OCT的效应。这些结果提示，局部注射 OCT所产生的抗伤害感受作用是通过外周SSTR发挥作用的［12］。与以往报道［7］的SST通过外周SSTR在大鼠和人类发挥抗伤害感受作用一致。

表2　局部注射OCT对PWM T的影响

表2　局部注射OCT对PWM T的影响

与BV组比较：*P＜0.05

项目对照组　BV组　OCT组对侧OCT组　c-SOM组预注射　4.53±0.61　4.08±0.39　4.93±0.49　4.31±0.54　4.20±0.31再注射　3.93±0.48*　2.12±0.66　4.99±0.59*2.73±0.58　3.08±0.29

表3　局部注射OCT对PW TL的影响

表3　局部注射OCT对PW TL的影响

与同一组预注射比较：*P＜0.05；与对照组再注射比较：#P＜0.05

项目对照组　BV组　OCT组对侧OCT组　c-SOM组预注射　12.52±0.80　11.82±0.26　11.40±0.54　12.06±0.2411.93±0.17再注射　12.60±0.78　10.64±0.65*#　8.86±0.76*#　10.64±0.11*#　10.64±0.27*#

抑制伤害感受信息的传递是SST激动剂发挥抗伤害感受作用的重要机制［6］。在炎症状态下，SST能降低前炎症性神经肽在感觉神经末梢的释放，从而下调伤害感受［7］。SST也能作用于血管内皮细胞、炎症细胞和免疫细胞上的受体，形成神经系统和免疫系统的交流网络，从而发挥抗炎和抗伤害感受作用［8］。文献［9］报道，SST能调节SD大鼠外周感觉神经末梢上的瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1，TRPV1）离子通道。SSTR2a受体与TRPV1共存于L5 DRG细胞，SSTR能够控制TRPV1受体离子通道的活性，后者在BV的致痛机制中发挥着重要作用［10］。在细胞水平，激活 SSTR开放多种钾通道并抑制电压依赖性钙通道［13］，从而导致抑制动作电位和神经递质的释放。

本研究显示，大鼠足底注射BV后同侧DRG中pCREB较对照组表达升高。文献［14］报道，CREB作为管家基因，在神经系统中参与多种生物功能的调控，如神经细胞的兴奋等。CREB通过特异性 DNA共有序列CRE激活c-jun和c-fos，从而调节即早基因或一些晚期效应基因的转录。部分坐骨神经结扎模型和福尔马林或角叉菜胶皮内注射引起的炎症均可引起脊髓背角神经元早期pCREB增加，同时也可诱导脊髓背角Fos和Jun-D表达升高［15］。伤害性刺激后pCREB可能是一个比Fos表达更好代表神经元活动的指标，因为其诱导更加迅速和敏感［16］。本研究显示局部注射OCT后，同侧L5 DRG中 pCREB表达较BV组明显减少，并出现了SSTR拮抗剂c-SOM预处理拮抗OCT这一效应。这一结果与前面观察到的行为学结果一致，提示pCREB调节的基因转录在BV导致的疼痛行为中起着重要作用。

综上所述，局部注射BV可导致DA大鼠产生自发疼痛行为、机械痛敏及热痛敏。通过激活外周局部SSTR，实现OCT抑制此自发疼痛及机械痛敏。此结果可为SSTRs在外周发挥镇痛作用提供新证据。OCT通过激活外周SSTR后，产生抗伤害感受作用，伤害感受信息传入减少使 DRG内pCREB表达降低，从而导致pCREB介导的痛觉信号转导减弱。本研究为探讨SSTR在外周抗伤害感受作用机制提供了新的资料，也为 SSTR激动剂OCT的局部镇痛作用和临床用药提供理论依据。

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Antinociceptive effect of octreotide in bee vemon test and its effect on the expression of pCREB in dorsal root ganglion

Tang Zhen1，Ouyang Zhengpeng2，Wang Hanyan3，et al
（1Dept of Biological Chemistry，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000；
2Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan Provincial People′s Hospital，Chengdu 610072；
3Key Laboratory of Thermoregulation and Inflammation of Sichuan Higher Education Institutes，Chengdu Medical College，Chengdu 610083）

Objective To investigate the antinociceptive effect of octreotide（OCT）in bee vemon（BV）test and its effect on the expression of pCREB in dorsal rootganglion（DRG）using a inbred Dark-Agouti（DA）rats，which was sensitive to nociception.In doing so，evidence for peripheral analgesic action of somatostatin receptor（SSTR）was expected to provide.Methods Intraplantar injection of50μl bee venom（BV）was performed tomake the nociceptivemodel.Adultmale DA ratswere randomly divided into 5 groups：the control group，BV group，OCT group，the contralateral OCT group and cyclosomatostatin（c-SOM）group.A stopwatch and counter was used to record the duration of lifting/licking and number of flinches.Up-down method was used to measure 50%mechanical paw threshold（PWMT）.PWMT was determined 1 h before injection BV aswell as 1.5 h after injection，respectively. Paw withdrawal thermal latency（PWTL）was used to present thermal stimulation reaction.Itwasmeasured half an hour before injection BV and 2 h after injection.Immunohistochemicalmethod was used to explore pCREB expression in DRG.Results After intraplantar injection of BV，the duration of lifting/licking in one hour in OCT group was reduced than the BV group（P＜0.05），PWMTwas bigger in OCT group than that in the BV group.However，there was no significant difference in the PWTL between OCT group and BV group.In addition，the percentage of positive cell of pCREB was higher in the BV group than that in the control group in ipsilateral DRG（P＜0.05）. Local OCT pretreatment significantly reduced the percentage of positive cell of pCREB in ipsilateral DRG（P＜0.05）.Conclusion Local OCT pretreatment reduced the spontaneous nociception andmechanical pain sensitivity. In addition，the expression of pCREB in the ispsilateral DRG is reduced.These effectsmay be due to the activation of peripheral SSTRs.

octreotide；bee venom pain；dorsal root ganglion；pCREB

Q 426

A

1000-1492（2016）05-0624-05

2016-02-22接收

国家自然科学基金（编号：81160141）；四川省教育厅自然科学基金（编号：15ZA0251）；成都医学院自然科学基金资助课题（编号：CYZ14-005）

1川北医学院生物化学教研室，南充 6370002四川省医学科学院、四川省人民医院心血管超声及心功能科，成都 610072

3成都医学院体温与炎症四川省高校重点实验室，四川610083

唐 珍，女，讲师，硕士；

罗 蓉，女，副研究员，博士，责任作者，E-mail：luorong77@ 126.com

*对本文具有同等贡献