肽钙螯合物的工艺研究

杨文博（黑龙江旅游职业技术学院生物工程系，黑龙江哈尔滨150086）

肽钙螯合物的工艺研究

杨文博
（黑龙江旅游职业技术学院生物工程系，黑龙江哈尔滨150086）

肽钙螯合物具有第一代、第二代和第三代钙制剂都无可比拟的优点，探讨最佳肽钙螯合方法：以螯合率为指标，对干酪素水解肽和钙螯合工艺进行研究，研究结果表明，最佳的螯合条件为肽钙质量比为2∶1，pH为8.0，温度为50℃，时间为40min，此时螯合率为72.78%。螯合率的高低除了以上讨论的5个因素之外，也有可能与蛋白质的种类及蛋白质水解产物中肽链的长短有关，肽链越短，越容易和钙离子螯合，而本试验在选择肽粉时是用复合酶水解的干酪素，这就使蛋白水解液中可能都是小分子肽，所以螯合率较高。

氯化钙；螯合；多肽

钙是人体内最重要的矿物质元素之一，是机体维持各项生命活动不可或缺无机元素，它参与人体的新陈代谢，并维持着人体许多细胞的正常运转工作。但人体对钙并不能够全部的吸收，通常有70%～80%不能够被吸收，而随着人体的代谢排出体外，主要原因是钙离子与一些事物中的酸性物质，例如草酸、脂肪酸等形成不溶于水的盐物质［1］。除此之外，钙的吸收还与人类年龄、人体的机能状态有关。

为了提高钙在人体的吸收利用程度，我国食品行业主要研发了三代钙制剂产品。第一代钙制剂产品主要以无机盐为主，这类钙制剂产品具有较高的含钙量，但它消耗了大量的胃酸，引起很大程度的副作用；第二代钙制剂产品主要以有机酸盐为主，这类钙制剂产品需要有维生素D的参与才可完成，而钙被人体吸收后大量进入血液，导致血清中游离钙含量的升高，虽说通过维生素D的调节，但稳定系统会使钙的吸收利用收到抑制；第三代钙制剂主要是氨基酸螯合钙，虽说这类钙制剂弥补了第一代和第二代钙制剂的不足，但它在螯合机制和转运方面与多肽螯合钙相比就存在着一定的缺陷［2］。

1　材料与仪器

肽粉、碳酸钙（AR）、氧化钙（AR）、硫酸钙（AR）、氯化钙（AR）：天津市本辰方正试剂厂；氢氧化钙（AR）：天津博迪化工股份有限公司；丙酮（AR）、乙醇（AR）：上海银典化工有限公司；二硫腙（AR）、茚三酮（AR）：天津市福晨化学试剂厂；真空抽气泵、FA1004B型电子天平、722S可见分光光度计、PHS-25C型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；80-1型沉淀离心机：上海手术器械厂；DZKW-8-6型电热恒温水浴锅：北京永光明医疗仪器厂；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

2　方法

2.1肽螯合钙的试验设计

干酪素水解肽粉在常温下不溶于水，因此本试验设计第一步就是要在加热的情况下将肽粉溶解，并加入钙源，在一定温度、pH和一定时间的条件下将肽钙螯合，螯合后的产物利用螯合物不溶于有机溶剂中不溶的原理将肽钙螯合物离心分离、抽滤并干燥得到螯合物的粗制品。

肽钙螯合工艺流程如下：

干酪素水解肽粉→蒸馏水溶解，并于37℃保温10 min使其溶解彻底→按比例加入可溶性钙源→混匀→调节pH→水浴保温一定时间进行肽钙的螯合→加入不同体积的有机溶剂沉淀→离心→沉淀洗涤→离心抽滤→鼓风干燥→得干酪素螯合钙制品［3］。

2.2含钙物质和有机沉淀剂的选择

市面上的有机含钙物质成本费用较高，因此本试验针对几种无机含钙物质［CaCO3、Ca（OH）2、CaO、Ca－SO4、CaCl2］在一些不同浓度的有机溶剂（丙酮、乙醇）和水中的溶解程度进行探讨，来确定本试验最佳钙源［4］。

2.3单因素试验设计

以干酪素水解肽螯合钙的螯合率作为指标，选取以下因素：肽钙质量比、pH、DH、螯合时间、螯合温度和乙醇用量进行单因素设计试验，反应结束后，将螯合物分离纯化后，通过测定其螯合率而确定最佳的螯合条件。

钙含量的测定选择EDTA滴定法（GB/T 5009.92-2003《食品中钙的测定》），螯合率的测定公式如下：

螯合率/%=螯合产物中钙含量/样品反应物中总钙含量×100

2.4正交试验设计

在单因素试验的基础上，选择肽钙体积比、pH、DH和时间这4个因素进行四因素三水平正交试验对螯合工艺进行优化，筛选出最佳的螯合工艺，因素水平设定见表1。

表1　因素水平编码表Table 1　The factor levels of design

3　结果与分析

3.1有机沉淀剂及钙源的选择

本试验在对无机钙源CaCO3、Ca（OH）2，CaO、Ca－SO4和CaCl2在水中进行溶解比较，除此之外本试验还针对几种不同钙源在不同体积分数的无水乙醇和丙酮溶液中的溶解情况进行试验而选择合适的有机沉淀剂。通过试验比较结果可知氯化钙在水中、不同浓度的丙酮和乙醇溶液中都有较高的溶解度，这就有利于肽钙螯合反应的进行，也有利于肽钙螯合物和游离钙的分离，因此本试验选择氯化钙为最佳的钙源。

3.2单因素试验设计的结果与分析

3.2.1肽钙比对肽钙螯合率的影响

配位体与金属离子的质量比是影响配位螯合反应的一个重要因素，配位比过高，会使多肽的利用率下降，不经济；配位体过低，螯合物不稳定。因此，本试验针对不同配位比下的螯合反应进行了研究，确定最佳的配位比。

将干酪素水解多肽与CaCl2按质量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1进行混合，调节pH8.0，充分搅拌使其均匀，在50℃下水浴保温40 min，之后加入8倍体积的无水乙醇，离心，抽滤，鼓风干燥得肽钙螯合物，测其螯合率，试验结果见图1。

图1　 肽钙质量比对螯合率的影响Fig.1　The effects of peptide calcium quality on chelating rate

从图1可以看出，质量比对螯合率影响很大，当肽钙质量比达到2∶1～3∶1时，反应体系中螯合率比较平缓，并达到最大值，随后，随着质量比的增加，螯合率反而下降，因此，本试验证明肽钙质量比为2∶1～3∶1为螯合最佳的肽钙配位比。

3.2.2pH值对肽钙螯合率的影响

将干酪素水解多肽与CaCl2按质量比3∶1进行混合，调节不同的pH进行试验（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），在50℃下水浴保温40min，之后加入8倍体积的无水乙醇，离心，抽滤，鼓风干燥得肽钙螯合物，测其螯合率［4］，选择最佳的pH，结果见图2。

从图2可以看出，产品的螯合率随着pH的升高而增大，到后来慢慢的趋于平缓，在碱性条件下的肽钙的螯合率明显高于酸性条件。当pH小于8.0时，肽钙的螯合率不高，当pH在8.0～10.0之间时，肽钙螯合率比较平缓，不会下降，但是碱性过强，而且产生的氢氧化钙沉淀，这些都会使产物产生一种不愉快的碱味，所以经本试验验证，肽钙螯合的最佳pH为8.0～9.0。

图2　pH对螯合率的影响Fig.2　The influence of pH value of chelating rate

3.2.3温度对肽钙螯合率的影响

将干酪素水解多肽与CaCl2按质量比3∶1进行混合，调节pH8.0，充分搅拌使其均匀，分别在不同温度下水浴保温40 min（20、30、40、50、60℃），之后加入8倍体积的无水乙醇，离心，抽滤，鼓风干燥得肽钙螯合物，测其螯合率，选择最佳的螯合温度，试验结果见图3。

图3　 温度对螯合率的影响Fig.3　The influence of temperature on the chelating rate

从图3可以看出，螯合率随着温度值的升高先增大后减小，在30℃～50℃时，螯合率明显呈上升的趋势，但当温度高于50℃时，肽钙螯合率将明显下降。说明温度过高不利于螯合反应的进行，升高温度可能会使蛋白质变性或使螯合物分解，也可能产生其他的反应。由此可见，螯合的最佳温度是50℃左右。

3.2.4时间对肽钙螯合率的影响

将干酪素水解多肽与CaCl2按质量比3∶1进行混合，调节pH8.0，充分搅拌使其均匀，在50℃温度下水浴保温20、30、40、50、60 min，之后加入8倍体积的无水乙醇，离心，抽滤，鼓风干燥得肽钙螯合物，测其螯合率，选择最佳的螯合时间，试验结果见图4。

由图4可以看出，随着时间的延长，螯合率是先增大后减小，在40 min时，肽钙的螯合率最大。有些文献报道，时间对螯合反应没有多大的影响，但本试验经过研究发现，随着时间延长，螯合率的走势呈抛物线的形状，这说明肽钙螯合物的生成是通过吸附反应发生着动态的吸附和解析的过程，在反应前期，吸附反应大于解析反应，肽钙进行着螯合，随着时间的延长，解析反应占主导，这就不利于肽钙的螯合，在40 min时，这种吸附解析过程达到了动态的平衡。因此，肽钙螯合的最佳时间是40 min。

图4　时间对螯合率的影响Fig.4　The effects of time on chelating rate

3.2.5沉淀剂用量对肽钙螯合率的影响

用无水乙醇沉淀分离螯合物时，沉淀剂的用量对产物的得率有一定的影响。因此，本试验将干酪素水解多肽与CaCl2按质量比3∶1进行混合，调节pH8.0，充分搅拌使其均匀，在50℃温度下水浴保温40 min之后，分别加入一定体积的无水乙醇（体系中乙醇浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%）沉淀螯合物，离心，抽滤，鼓风干燥得肽钙螯合物，测其螯合率，确定最佳的沉淀剂用量，试验结果见图5。

图5　无水乙醇浓度对螯合率的影响Fig.5　The effects of anhydrous ethanol concentration on chelating rate

从图5可以看出，当无水乙醇的浓度低于80%时，随着无水乙醇的加入，螯合率有明显的增加，但是当乙醇浓度达到80%时，继续增加无水乙醇的用量，螯合率的变化不大。说明加入无水乙醇的量不足的话，乙醇会被溶液中的水稀释，一定量的螯合物会溶解到乙醇-水溶液中，造成螯合物的损失；所以无水乙醇的加入量越多，螯合物分离的效果越好，但是，当无水乙醇加到一定量的时候，在继续加入无水乙醇，螯合物的得率不再变化，如果此时在继续加入乙醇，势必会造成不必要的浪费。综上所述，沉淀剂无水乙醇的用量最好的是80%即可。

3.3正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，选择肽钙质量比、pH、干酪素水解度和螯合时间这4个因素进行四因素三水平的正交试验，根据试验结果对螯合工艺进行优化，删选出最佳肽钙螯合条件。

干酪素水解多肽螯合钙正交优化试验结果见表2。

表2　正交试验结果Table 2　The results of orthogonal experiment

由表2可知，肽钙比、pH、螯合温度、螯合时间对肽钙螯合率均有影响，影响的次序依次为肽钙比＞pH值＞螯合温度＞螯合时间，最佳组合条件为A1B2C2D2，即肽钙质量比为2∶1、pH为8.0，螯合温度为50℃，螯合时间为40 min，此时多肽螯合钙的螯合率为72.78%。

根据正交试验结果进行正交试验方差分析，找出影响肽钙螯合的极显著因素和显著因素，正交试验方差分析表见表3。

表3　 正交试验方差分析表Table 3　Orthogonal experiment anova table

从表3方差分析结果可知，肽钙比对螯合率影响最大，呈极显著水平，pH对肽钙螯合率的影响次之，呈显著水平。

4　结论

在肽钙螯合钙制品工艺研究中，通过选择合适的钙源，严格控制肽钙质量比、温度、pH和时间这些螯合条件，选择无水乙醇作为有机沉淀剂，分离沉淀肽钙制品，本课题通过单因素试验和四因素三水平正交试验，确定最佳螯合工艺为钙源选择为氯化钙，有机沉淀剂为无水乙醇且无水乙醇的用量为80%，肽钙质量比为2∶1，pH为8.0，螯合温度为50℃，时间为40 min，这就得到螯合率为72.78%的肽钙螯合制品。

［1］于平，励建荣.补钙剂的现状及营养评价方法［J］.中国食品学报，2002，2（1）：57-61

［2］曾敏莉，周远大.钙制剂的现状及发展趋势［J］.儿童药学杂志，2004，10（3）：16-18

［3］孙莉洁，梁金钟.响应面法优化大豆肽与钙离子螯合的研究［J］.中国粮油学报，2010，25（1）：22-27

［4］原龙，王新.牛奶中酪蛋白和乳糖的分离方法研究［J］.应用化工，2009，38（3）：389-394

Study on the Process of Peptide Calcium Chelate

YANG Wen-bo
（Department of Biological Engineering，Heilongjiang Vocational College of Tourism，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

Calcium peptide chelate has at present，the first generation，second and third generation calcium preparations are incomparable advantages，this topic discusses the best method of peptide chelate calcium：with the aojiang rate as index，hydrolysis of casein peptide and calcium aojiang process was studied，the results showed that，the best aojiang eligible for peptide calcium quality ratio of 2∶1，pH 8.0，temperature of 50℃，time of 40 min，the rock at a rate of 72.78%.Rock and rate of five factors in addition to the above discussion，it is also possible and the types of protein and protein hydrolysate in the length of the peptide chain，the shorter the peptide chain，the easier and calcium aojiang，and this study choose the casein hydrolysis enzyme is a complex enzyme，this makes may be small molecular peptide protein hydrolysate，so the aojiang rate is higher.

calciumchloride；chelate；polypeptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.034

杨文博（1983—），女（汉），中级讲师，硕士，研究方向：食品检验检测。

2015-08-19