葛根多糖的基本理化特性研究

陈兵兵，王振斌（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

葛根多糖的基本理化特性研究

陈兵兵，王振斌*
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

为了研究葛根多糖的基本理化特性，采用脱脂脱蛋白后的葛根多糖过DEAE-52纤维素柱得到的样品PS-D1、PS-D2、PS-D3为原料，研究3组样品的分子量分布，基本外貌形态，刚果红反应和体外抗氧化的测定。结果表明：3种组分的分子量分散系数比较集中，分别为1.4、1.9和1.4，外貌形态经SEM扫描分析为纤维树枝状，片状或碎屑状堆积，刚果红分析表明3种多糖不具有三螺旋结构，在水溶液中表现为无规线团链构象。体外抗氧化结果表明葛根多糖有较好的DPPH自由基的清除能力且它们的半抑制率IC50值分别为3.14、2.85、2.31 mg/mL，并且均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，其中PS-D3的等价抗氧化能力（TEAC）最好，为（53.83 μmol Trolox/g样品）。葛根多糖的基本理化特性研究为葛根的开发及综合利用提供了理论参考。

葛根；多糖；理化特性；抗氧化

葛根（Pueraria）为豆科葛属多年生落叶藤本植物的肥大块根，是一种药食两用的植物。葛根可分为两种，即粉葛和野葛。粉葛富含淀粉，是重要的食材及食品添加剂；野葛中富含异黄酮类、多糖类、氨基酸及微量元素等物质，具有重要的药理功能和药用价值［1］。葛根在全国大部分地区都有分布［2］，具有清除自由基、抗人体衰老、抗凝血、降血糖等生理功能［3］，深受国内外市场的欢迎，发展潜力很大。

多糖是构成生命的四大基本物质之一，由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。分子量从几万到几千万，具有许多生物活性，包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用［4］。多糖广泛存在于高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中，不但是生物体的重要组成部分还参与多种生理功能。已有研究显示葛根多糖具有抑菌作用［5］，且多糖的生物活性与多糖的结构存在重要的构效关系［6］。目前针对葛根的研究主要集中在葛根黄酮类物质，而葛根多糖的一些研究较少报道，因此本文主要研究了葛根多糖的基本特性如分子量测定、扫描电镜（SEM）、刚果红等，并在最后对其体外抗氧化性进行了分析，为葛根多糖的应用提供了理论参考，提升了葛根的市场应用价值。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葛根：句容茅宝葛业有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、过硫酸钾、1，1-二苯基-2-苦肼基、刚果红、ABTS：美国sigma公司等。

1.2仪器与设备

UV-1601型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；Agilent 100型液相色谱：美国Agilent公司；DAWN HELEOS-Ⅱ型多角度光散射仪：美国Wyatt公司；DL-5C离心机：上海安亭科学仪器厂；FD-8型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3方法

1.3.1多糖的提取与纯化

葛根粉碎后过100目筛，称取一定量葛根粉加石油醚脱脂处理。多次称取脱脂后葛根20 g，按料液比1∶20（g/mL），在90℃条件下回流提取4 h，合并上清液，真空浓缩。并以Sevage法除蛋白，离心（4 500 r/min，10 min）去除有机相与水相交界处乳化层。合并上清液，加4倍的无水乙醇沉淀多糖，4℃静置过夜，收集的沉淀物再用蒸馏水复溶，透析48 h后冻干得葛根粗多糖。取适量粗多糖用蒸馏水溶解过DEAE-52纤维素柱，分别以蒸馏水、0.1 mol/L和0.2 mol/L的NaCl溶液进行洗脱得PS-D1、PS-D2、PS-D3 3种组分。

1.3.2多糖分子量的测定

采用尺寸排阻色谱和多角度激光光散射联用测定分子量和分子量分布。色谱柱采用DB-806～805 MHQ串联型（DB-806 MHQ，8 mm Ф×30 cm，shodex，Japan）水相柱，尺寸排阻色谱装置采用WATERS 1515型泵和示差折光检测器。样品用0.1 mol/L的氯化钠溶液配置成1.0mg/mL的多糖溶液，柱温25℃，进样量100μL，流速为0.5 mL/min，进样前过0.22 μm膜处理，流动相为0.1 mol/L氯化钠溶液。

1.3.3多糖的扫描电镜（SEM）观察［7］

将充分干燥精制的葛根多糖用离子溅射镀膜法制备电镜样品，置于扫描电镜的样品室中扫描分析，调节加速电压15 kV，用随机工作站进行拍摄，观察多糖表面的形态。

1.3.4刚果红反应

刚果红与多糖的相互作用是通过多糖在不同溶液体系中与刚果红反应的最大吸收波长来评价的。分别取浓度为1.0 mg/mL等体积的多糖PS-D1、PS-D2、PS-D3溶液与91 μmol/L的刚果红溶液混合，然后加入4.0 mol/L NaOH溶液充分混合，使溶液中NaOH浓度在0～0.5 mol/L范围内变化。在400 nm～700 nm波长范围内用紫外-可见分光光度计进行扫描，测定不同NaOH浓度条件下的最大吸收波长，以蒸馏水作为空白。

1.3.5DPPH自由基清除率的测定

采用文献 ［8］方法并加以部分修改。取1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液分别加入到3 mL不同浓度的多糖样品液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）中，暗处反应30 min后于517 nm条件下测其吸光值，以VC作为阳性对照组。按式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0以去离子水为空白对照时的吸光值；A1为含样品和DPPH时的吸光值；A2为含样品和去离子水时的吸光值。

1.3.6等价抗氧化能力（TEAC）测定［9］

ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+·发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS+·这种自由基的最大吸光波长下检测吸光度的变化，与Trolox的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力。

称取过硫酸钾13.2 mg加入到20 mL已配制好的7.4 mmol/L的ABTS溶液中，暗处搅拌12 h～16 h，然后用pH为7.4的PBS缓冲液稀释至在734 nm处吸光值为0.70的溶液。取100 μL样品液加入到3.90 mL已反应完的ABTS溶液中，室温20 min后于734 nm测其吸光值A。样品的清除自由基能力按照方程（2）计算。

式中：A为ABTS溶液中有样品时的吸光值；A0为ABTS溶液中不存在样品时的吸光值。

Trolox标准曲线的绘制：以不同浓度的Trolox溶液为样品按照上述方法操作，制作Trolox清除率和其浓度的标准曲线，如图1所示。

图1　Trolox标准曲线Fig.1　The standard curve of Trolox

2　结果与分析

2.1葛根多糖的纯化制备

葛根多糖的洗脱曲线如图2所示。

图2　葛根多糖的洗脱曲线Fig.2　The elution curve of polysaccharide from Pueraria

根据洗脱曲线分别收集主峰管中的样品，浓缩透析冻干得到3种组分PS-D1、PS-D2、PS-D3，其得率分别为23.14%、47.52%和10.17%。

葛根多糖的全波长扫描如图3所示。

图3　 葛根多糖的全波长扫描Fig.3　The full wavelength scanning of polysaccharide from Pueraria

从图3可知，葛根多糖样品在280 nm和260 nm波长处无吸收，表明其不含蛋白、多肽及核酸。在520 nm波长处无吸收，表明其不含色素类物质［10］。

2.2分子量的测定

葛根多糖的分子量如表1所示。

表1　 葛根多糖的分子量Table 1　Molecular weight of polysaccharide from Pueraria

由表1可以看出样品PS-D3的分子量较大，分散性指数较小，3种组分的多糖分散性指数都较小表明这3种组分的多糖分子量比较集中。

2.3表观形貌结果

利用扫描电子显微镜（SEM）观察葛根多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的固态表观形貌如图4～图6所示。

图4　PS-D1扫描电镜照片Fig.4　The scanning electron microscope photos of PS-D1

图5　PS-D2扫描电镜照片Fig.5　The scanning electron microscope photos of PS-D2

图6　PS-D3扫描电镜照片Fig.6　The scanning electron microscope photos of PS-D3

PS-D1和PS-D2呈纤维树枝状，可能是由于许多分子或分子集团聚集成不同样式的束所致，PS-D1所形成的束大部分比PS-D2的细一些。此外多糖分子间存在大量的无规则交叉网状结构，表明结构中存在较强的分子间相互作用。PS-D3呈片状或碎屑状堆积，表面形貌光滑，即多糖存在一定的聚集体，分子的规整性不强，当放大倍数达到1000倍时可以看到含有聚集态乳状结构。

2.4刚果红分析

葛根多糖与刚果红溶液混合物随NaOH浓度变化而表现出来的最大波长的变化如图7所示。

图7　不同NaOH浓度下多糖与刚果红的最大吸收波长Fig.7　The maximum absorption wavelength of polysaccharide with Congo red under different NaOH concentrations

从图7中可以看出，随着NaOH浓度的增大，多糖-刚果红溶液的最大吸收波长均呈现减小的趋势，表明这3种组分的多糖不具有三螺旋结构，在水溶液中表现为无规线团链构象。

2.5DPPH自由基的清除

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm处有强吸收。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，DPPH的单电子被配对，颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成剂量关系。因此，可通过测定此波长处的吸光度来评价自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力，样品的抗氧化能力以清除率表示，清除率越大，抗氧化性越强。

3种组分的多糖对DPPH自由基清除能力如图8所示。

从图8中可以看出，3种多糖均具有很好的DPPH自由基的清除能力，随着样品浓度的增大清除效果也在增加，且PS-D1、PS-D2和PS-D3的半抑制率IC50值分别为3.14、2.85 mg/mL和2.31 mg/mL，VC的半抑制率IC50值为0.26 mg/mL，其中PS-D3的IC50值和VC的较为接近，表现出较好的清除效果。

2.6等价抗氧化能力（TEAC）

ABTS+·是一种稳定的有机自由基，所测试的样品抗氧化能力越强其提供电子的能力就越强，可以通过测定反应液的吸光度的变化直接反应样品的抗氧化能力。

图9为葛根多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的TEAC值。

图8　多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3的DPPH自由基清除能力Fig.8　Antioxidant activities of PS-D1，PS-D2 and PS-D3 by scavenging ability on DPPH

图9　多糖PS-D1、PS-D2和PS-D3等价抗氧化值Fig.9　TEAC assays of PS-D1，PS-D2 and PS-D3

从图9中可以看出3种组分的多糖均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，且0.2 mol/L NaCl洗脱组分多糖PS-D3的TEAC值最大（53.83 μmol Trolox/g样品）。

3　结论

针对不同洗脱液洗脱收集的样品PS-D1、PS-D2 和PS-D3，它们的分子量分散系数分别为1.4、1.9和1.4，3种组分的多糖分子量比较集中，为以后研究构效关系奠定了理论基础。扫描电镜结果首次揭示了葛根多糖的基本形态外貌，PS-D1和PS-D2呈纤维树枝状，可能是由于许多分子或分子集团聚集成不同样式的束所致，PS-D1所形成的束大部分比PS-D2的细一些。PS-D3呈片状或碎屑状堆积，表面形貌光滑，即多糖存在一定的聚集体，分子的规整性不强，当放大倍数达到1000倍时可以看到含有聚集态乳状结构。刚果红结果分析表明这3种组分的多糖不具有三螺旋结构，在水溶液中表现为无规线团链构象。体外抗氧化结果可以看出3种组分多糖均具有很好的DPPH自由基的清除能力，随着样品浓度的增大清除效果也在增加且PS-D1、PS-D2和PS-D3的半抑制率IC50值分别为3.14、2.85 mg/mL和2.31 mg/mL，且均含有一定的清除ABTS+自由基的能力，0.2 mol/L NaCl洗脱组分多糖PS-D3的TEAC值最大（53.83 μmol Trolox/g样品）。葛根多糖的基本理化特性研究结果可以很好的为葛根的开发及综合利用提供理论参考，体外抗氧化活性的分析可以指导葛根多糖在生物医疗上的应用。

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Study on the Basic Physical and Chemical Properties of Polysaccharide from Pueraria

CHEN Bing-bing，WANG Zhen-bin*
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

In order to study the basic physical and chemical properties of the polysaccharides from Pueraria，the raw material PS-D1，PS-D2 and PS-D3 were obtained from the samples obtained from the DEAE-52 cellulose column after defatted and deproteinized.The molecular weight distribution，the basic form of appearance，Congo red and anti-oxidation in vitro assays were studied.The results showed that：the molecular weight of the three components of the dispersion coefficient was relatively concentrated，respectively，1.4，1.9 and 1.4.The morphology of the surface was analyzed by SEM scanning，which was fibrous，patchy or debris，Congo red analysis showed that the polysaccharides without three helix structure，in aqueous solution was a random coil chain conformation.The antioxidant results showed that polysaccharide had a better DPPH radical scavenging ability and their half inhibition rate IC50values were 3.14，2.85 and 2.31 mg/mL，respectively.And they contained the ability of scavenging free radicals ABTS+，which PS-D3 equivalent antioxidant capacity（TEAC）was the best of 53.83 μmol Trolox/g sample.The study of the basic physical and chemical properties of the polysaccharide from the Pueraria provided the theoretical basis for the development and comprehensive utilization of the Pueraria.

Pueraria；polysaccharide；physicalandchemicalproperties；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.003

国家级星火计划（2013GA690310）；江苏省科技支撑计划（NY2012013，GY2012021）

陈兵兵（1990—），男（汉），在读硕士研究生，主要研究生物活性物质。

王振斌（1975—），男（汉），教授，博士生导师，博士，主要从事农产品生物加工技术研究。

2015-08-28