慢性肾脏病患者肾组织中Klotho基因启动子羟甲基化水平观察

王焕，张慧，崔凯，冯衍生

(1新乡市中心医院，河南新乡453000；2新乡医学院)



慢性肾脏病患者肾组织中Klotho基因启动子羟甲基化水平观察

王焕1，张慧2，崔凯1，冯衍生2

(1新乡市中心医院，河南新乡453000；2新乡医学院)

目的观察慢性肾脏病(CKD)患者Klotho基因启动子羟甲基化水平变化，并探讨其与CKD临床病理参数的关系。方法1～3期CKD患者58例，肾脏穿刺取肾脏组织(CKD组)；肾结核患者31例，取手术切除的正常肾脏组织(对照组)。将各组抽提的全基因组DNA分为两份，一份以15 mmol/L高钌酸钾、0.05 mol/L氢氧化钠氧化后，进行亚硫酸盐转化；另一份直接进行亚硫酸盐转化。用特异引物进行PCR扩增，焦磷酸测序，检测羟甲基化并计算其在甲基化中所占比例。分析Klotho基因启动子羟甲基化水平与CKD临床病理参数的关系。结果对照组肾脏组织Klotho基因启动子羟甲基化修饰；CKD组肾脏组织Klotho基因启动子甲基化水平高于对照组，羟甲基化水平低于对照组(P均<0.05)。CKD患者Klotho基因启动子羟甲基化水平与eGFR呈正相关关系，与肾小管间质纤维化面积及肌酐水平呈负相关。结论CKD患者肾脏组织中Klotho基因启动子羟甲基化水平降低，并与CKD临床病理参数有关。Klotho基因启动子羟甲基化水平下降可能参与了CKD的发生发展。

慢性肾脏病；Klotho基因；基因启动子；羟甲基化

慢性肾脏病(CKD)是指一类在各种致病因子影响下，以肾脏慢性纤维化为病理特征的临床疾病的总称，发病率较高[1]。由于CKD缺乏有效治疗手段，最终导致肾功能逐渐恶化，进展为终末期肾病需行肾脏替代治疗，严重影响患者生活质量。研究[2～5]表明，肾脏功能发生异常多伴随Klotho表达下降。Klotho基因启动子甲基化被证明与CKD有关。但对于Klotho基因启动子甲基化水平是如何发生动态变化、其CpG岛甲基化是否还存在其他种类修饰目前尚不清楚。近年研究较多的羟甲基化是一种以5甲基胞嘧啶(5mC)为基础发生的氧化去甲基化修饰，被认为是潜在的基因转录重新激活标志。本研究观察了CKD患者肾组织中Klotho启动子羟甲基化水平，并探讨其与CKD临床病理参数的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2008年7月～2013年7月在新乡市中心医院肾内科行肾穿刺活检的CKD患者共58例为CKD组，排除糖尿病、自身免疫疾病、肿瘤、乙型肝炎、丙型肝炎及曾使用激素或免疫抑制剂的患者。58例患者中，男28例、女30例，年龄(45.2±12.3)岁，膜性肾病20例、IgA肾病15例、局灶节段性肾小球硬化10例、新月体肾炎5例、高血压肾小动脉硬化3例、肾小球轻微病变5例，按照eGFR进行分期1期25例、2期18例、3期15例，肾活检术中取病理组织。选择肾结核患者31例为对照组，男15例、女16例，年龄(48.5±1.2)岁，取手术切除的正常肾脏组织。两组性别、年龄资料有可比性。CKD组eGFR、肌酐水平、肾小管间质纤维化面积与对照组相比，P均<0.05。见表1。

表1　两组患者年龄、eGFR、肌酐及肾小管间质纤维化面积比较±s)

注：与对照组相比，*P<0.05。

1.2肾组织中Klotho基因启动子羟甲基化检测抽提两组肾脏组织总DNA 2 μg，分为两组。氧化组进行15 mmol/L高钌酸钾、0.05 mol/L氢氧化钠氧化(BSP)后，进行亚硫酸盐转化(oxBS)；未氧化组直接进行oxBS[6]。oxBS后进行PCR扩增，利用Pyro Mark Assay Design2.0软件设计引物，上游引物序列为5′-GGGAGTTGGGAGAAATAGG-3′，下游引物序列为5′-CCAACAACACCAACAACA-3′，测序引物序列为5′-GGGAGAGGGGGTGGG-3′，产物长度351 bp。其中上游引物5′端进行生物素标记。扩增所得的PCR产物进行切胶回收，进行焦磷酸测序。氧化组中胞嘧啶会变成胸腺嘧啶，5mC不发生变化，5羟甲基化胞嘧啶(5hmC)会转化成胸腺嘧啶；未氧化组中5mC、5hmC均不发生变化，据此可识别存在羟甲基化修饰的CpG位点。每个CpG位点的甲基化结果根据CpG对应位点C/T百分比进行分析。0代表胞嘧啶完全羟甲基化，100%代表胞嘧啶完全甲基化[7]。

1.3尿素氮、肌酐水平测定两组清晨空腹抽取血样，检测血清尿素氮、肌酐。根据MDRD简化公式计算eGFR[8]。

1.4肾小管间质纤维化面积的测算将肾脏组织放于预先配好的固定液中进行固定，再用低至高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织置于透明剂二甲苯中透明，之后浸蜡包埋，在切片机上进行切片，常规HE染色。病理结果根据盲法原则，由两位病理医师对肾小管萎缩和间质纤维化占皮质肾组织面积的百分比进行评价。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软进行统计分析。计量资料比较采用方差分析；相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肾组织中Klotho基因启动子甲基化、羟甲基化水平CKD1、2、3组肾组织Klotho基因启动子甲基化水平高于对照组，且Klotho基因启动子大部分CpG位点甲基化水平随着CKD分期增高逐渐升高。对照组肾组织中Klotho基因启动子-81、-71、-63位点存在羟甲基化修饰；CKD组肾组织Klotho启动子羟甲基化水平显著降低，且随着病情严重程度增加，羟甲基化水平逐渐下降，其中在CKD2、3组-81、-71、-63位点BSP与oxBS差异无统计学意义(见表2)。

表2　各组肾组织Klotho基因启动子-86～-51位点CpG岛羟甲基化水平

2.2CKD患者Klotho启动子羟甲基化率与临床病理特征的相关性CKD患者整体羟甲基化水平与eGFR有关(F=276.035，P<0.01)，-81位点(R2=0.848，P<0.01)、-71位点(R2=0.885，P<0.01)、-63位点(R2=0.709，P<0.01)羟甲基化水平与eGFR均呈正相关关系；CKD患者整体羟甲基化水平与肌酐水平有关(F=26.796,P<0.01)，-81位点(R2=-0.773，P<0.01)、-71位点(R2=-0.782，P<0.01)、-63位点(R2=-0.728，P<0.01)羟甲基化水平与肌酐水平均呈负相关关系；CKD患者整体羟甲基化水平与肾小管间质纤维化面积有关(F=124.285，P<0.01)，-81位点(R2=-0.887，P<0.01)、-71位点(R2=-0.884，P<0.01)、-63位点(R2=-0.827，P<0.01)羟甲基化水平与肾小管间质纤维化面积均呈负相关关系。

3　讨论

5mC作为第五种碱基，是DNA水平最常见的表观遗传学修饰，其可被甲基化结合蛋白(MBP)特异性识别，招募转录抑制复合体，通过改变染色体构象等方式抑制RNA pol聚合酶对启动子的结合，最终引起相应基因沉默[9]。DNA的去甲基化有很多种方式[10～13]，其中由羟甲基化酶(TET)介导的羟甲基化修饰在合子形成初期的重编程、早期胚胎发育、干细胞自我更新和分化、肿瘤发生和转移等过程中均发挥重要作用[14]。由于5hmC不被MBP识别，因此并不引起转录沉默，被普遍认为是基因转录表达重新激活的标志。目前对5hmC的研究主要集中在全基因组水平，对单基因尤其是某个CpG岛或CpG位点的研究很少。本研究采用oxBS结合常规BSP的方法，能够在特定CpG位点水平有效识别并检测羟甲基化修饰。

Klotho是一个抗衰老基因，其在肾脏、血浆及尿液中水平升高提示肾功能受到影响。此前已有研究表明Klotho基因启动子甲基化与其表达水平呈负相关[2]。Klotho基因中存在一些甲基化状态保持相对稳定的CpG位点，其甲基化水平较高且并不随肾功能异常而有明显改变，通过对这些位点进行oxBS分析，能够反映羟甲基化修饰情况。本研究结果显示，CKD组Klotho基因启动子羟甲基化水平低于对照组，且随着CKD分期增高而下调，提示Klotho基因启动子羟甲基化水平下调参与了CKD的发生发展。由于BSP无法区分5mC和5hmC，以及5hmC的形成需要5mC作为底物，在低甲基化状态中是不存在羟甲基化修饰的，因此可以解释-81、-71、-63位点始终保持较高的甲基化状态。

本研究结果还显示，CKD患者Klotho基因启动子羟甲基化水平与eGFR呈正相关关系，表明羟甲基化水平会随着CKD进展而下降，一旦肾功能出现障碍，羟甲基化水平变化幅度较整体甲基化水平变化更为敏感。我们还发现，Klotho基因羟甲基化水平与肾小管间质纤维化面积及肌酐水平均呈负相关关系，提示Klotho基因羟甲基化水平能在一定程度上反映CKD患者肾脏受损情况。

此前有研究认为，CKD患者Klotho基因启动子发生超甲基化，同时其表达受到抑制。这种超甲基化的形成一方面是通过对普通胞嘧啶进行甲基化修饰并转化成5mC，这种变化主要发生在无羟甲基化修饰的CpG位点；另一方面可能是抑制TET酶等功能，阻滞5hmC形成及其后的主动去甲基化过程，这种变化主要发生在有羟甲基化修饰的CpG位点。我们推测，在正常肾脏组织中，Klotho基因启动子-81、-71、-63位点羟甲基化修饰同样有利于Klotho基因的转录表达，但为何羟甲基化修饰只出现在某些CpG位点，原因仍然未知。

总之，本研究证明正常肾组织Klotho基因启动子上存在羟甲基化修饰，而CKD患者肾组织中Klotho基因启动子羟甲基化修饰水平显著下降。Klotho基因启动子羟甲基化有望作为一种新的表观遗传学标记用于CKD的早期诊断及病情评估。然而，由于肾穿刺活检取材复杂，未来是否可以采用其他方法如外周血检验来代替肾穿刺活检尚需进一步研究。对于Klotho基因羟甲基化对CpG位点的偏好性、涉及到哪个TET成员参与羟甲基化修饰作用、治疗后Klotho基因启动子羟甲基化状态如何变化，都有待于进一步探索。

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冯衍生(E-mail: 47300725@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.034

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1002-266X(2016)15-0089-03

2015-09-30)