万古霉素耐药折点调整对异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌筛选方法的影响

刘明涛，李凯述，李 超，欧阳修河

万古霉素耐药折点调整对异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌筛选方法的影响

刘明涛，李凯述，李 超，欧阳修河

目的 探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）（MRSA）对万古霉素耐药的折点调整后，对异质性万古霉素中介金葡菌（hVISA）的平皿筛选方法选择的影响，寻求一种敏感、有效的平皿筛选方法。方法 收集临床MRSA菌株215株，分别用浓度为6 mg/L、4 mg/L、2 mg/L万古霉素脑心浸液琼脂平皿（BHIV6、BHIV4、BHIV2）及浓度为5 mg/L替考拉宁脑心浸液琼脂（BHIT5）进行hVISA筛选，同时应用菌群分析/曲线下面积（PAP/AUC）法检测hVISA，以PAP/ AUC法作为金标准，对比上述4种平皿筛选方法的敏感度及特异度。结果 PAP/AUC检测hVISA的阳性菌株分别为12株，BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5筛选阳性菌株分别为6、18、54、20株；以PAP/AUC法作为金标准，上述4种平皿筛选方法灵敏度分别为 41.7 %、83.3 %、91.7 %、83.3 %，特异度分别为 99.0 %、95.9 %、77.8 %、94.8 %。结论 MRSA对万古霉素耐药折点调整后，BHIV6筛选法灵敏度较低、BHIV2筛选法特异度较低，不应作为hVISA的筛选方法，BHIV4和BHIT5平皿筛选法灵敏度和特异度均较高，可作为万古霉素耐药折点调整后对hVISA的常规筛选方法。

金黄色葡萄球菌； 万古霉素耐药； 实验室技术和方法

近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）（MRSA）检出率逐年升高［1］，随着万古霉素的广泛应用，出现了对万古霉素敏感性下降的金葡菌，包括万古霉素中介金葡菌（VISA）和异质性万古霉素中介金葡菌（hVISA），其中VISA目前临床检出率较低［2］，但世界各地陆续有hVISA的报道，检出率在0.5 %～20 %［3-4］。目前检测hVISA的初筛方法较多，但应用最为广泛的筛选方法为含药琼脂平皿法。美国CDC与CLSI推荐用浓度为6 mg/L万古霉素或5 mg/L替考拉宁的脑心浸液琼脂平皿筛选。但2006年CLSI就金葡菌对万古霉素的耐药折点进行了调整，中介范围降至4～8 mg/L，随着折点的下调，含药琼脂平皿筛选法也应当调整。本研究用不同浓度万古霉素和替考拉宁脑心浸液琼脂进行hVISA筛选，同时以菌群分析/曲线下面积（PAP/ AUC）法［5］作为金标准，对比筛选方法灵敏度及特异度，探求耐药折点变化后hVISA琼脂平皿合理筛选方案。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 收集山东省15所三级医院2014 年3月1日-2015年4月20日分离的MRSA临床菌株215株，标本分别来自痰液125株，血液32株，分泌物58株，依次编号为SA001-SA215，所有菌株均经VITEK 2-Compact仪鉴定。质控菌株：金葡菌ATCC 29213为本实验室保存菌株，标准菌株Mu3（ATCC 700698）购自美国标准菌收藏所。

1.1.2仪器与培养基 VITEK全自动细菌鉴定仪及比浊仪均为法国生物梅里埃公司生产，螺旋涂布仪由中国食品药品检定研究院提供，万古霉素购自礼来公司，MH琼脂、脑心浸液琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤均为英国OXIOD公司产品。

1.2检测方法

1.2.1PAP/AUC［6］首先配置含系列浓度的万古霉素脑心浸液琼脂平皿（BHIV）：每 400 mL脑心浸液琼脂中分别加入0.01 mg/L万古霉素母液10、20、40、80、100、120、160、320 μL，配制成0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4、8、16 mg/L 8个浓度的BHIV平皿。挑取血平皿上培养过夜的纯菌落，加入到8 mL 胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，37 ℃空气浴中振荡培养，24 h后将菌液取出并定义为原液。借助于比浊仪，用无菌生理盐水将原液分别稀释为10-3CFU/mL和10-6CFU/mL 2种浓度菌液，用螺旋涂布仪将原液及稀释菌液分别涂布至上述8个浓度的BHIV 平皿上。晾干后于37 ℃温箱培养48 h。选用3个不同浓度中单个菌落生长最好的平皿，采用计数圆盘进行菌落计数，实际菌落数应为稀释度乘以该稀释度下平皿上的菌落数。利用Graphpad Prism 软件绘制菌落数log对数值对万古霉素浓度的曲线并计算AUC。将待测菌株的AUC 与Mu3 的 AUC 进行比较。目前公认的确认标准为（AUC待测菌株/AUC Mu3比值）：万古霉素敏感金葡菌（VSSA）＜0.9；hVISA≥0.9～＜1.3；VISA≥1.3。

1.2.2万古霉素琼脂平皿筛选法 2006年CLSI对金葡菌的万古霉素耐药折点进行了较大的调整，中介范围降至4～8 mg/L，敏感范围为≤2 mg/L，因此，再用含有6 mg/L万古霉素的脑心浸液琼脂平皿（BHIV6）筛选hVISA，必将造成筛选的敏感性下降，部分hVISA菌株会漏检。本研究认为，随着金葡菌对万古霉素耐药折点的下调，hVISA的含药琼脂平皿中万古霉素浓度也要适当降低，我们选择2 mg/L（BHIV2）、4 mg/L（BHIV4） 2个较低的浓度进行筛选，同时应用原来6 mg/L的浓度，对筛选结果进行比对。

有研究报道，在含药平皿中加入16 g/L胰酶消化酪蛋白可以有效提高筛选率［5，7］。因此，本研究在所有琼脂平皿上均加入该浓度的胰酶消化酪蛋白。以BHIV4为例配置平皿，以脑心浸液琼脂26 g ，胰酶消化酪蛋白8 g，蒸馏水500 mL的比例配制并高温高压灭菌；待冷却至 45～50 ℃，每500 mL 琼脂中加入预温至50 ℃，2 000 mg/L万古霉素母液1 mL，即配制成含16 g/L胰酶消化酪蛋白和4 mg/L 万古霉素的脑心浸液琼脂平皿，余以此类推。挑取血平皿上培养过夜的纯菌落，借助比浊仪，用无菌生理盐水配置0.5麦氏单位浓度的菌液备用。分别取4滴不同浓度的菌液接种于含不同浓度药物的BHIV上不同部位，35 ℃培养48 h，以48 h至少1滴接种物处有≥2菌落生长为hVISA阳性，以Mu3为阳性对照菌株。

1.2.3替考拉宁琼脂平皿筛选法 用含有5 mg/ L替考拉宁脑心浸液琼脂平皿（BHIT5）筛选是最初筛选hVISA的标准初筛方法，本试验在对比不同浓度万古霉素平皿筛hVISA的特异度及灵敏度的同时，也对比替考拉宁筛选方法的灵敏度及特异度，观察耐药折点调整后，该方法能否继续作为初筛方法。具体方法：挑取血平皿上过夜培养的MRSA纯菌落，用0.85 %无菌氯化钠配制成浊度为2.0麦氏单位的菌悬液，吸取10 µL菌液点种于含有替考拉宁5 mg/L的BHI琼脂上，室温晾干后于35 ℃培养，24 h和48 h各观察1次，以48 h时筛选平皿有≥1个菌落为阳性标准。

2　结果

2.1hVISA的PAP/AUC检测结果及临床分离率

经PAP/AUC方法检测，hVISA阳性菌株为12株，分别为SA012、SA025、SA064、SA077、SA105、SA112、SA118、SA130、SA138、SA165、SA179、SA201，hVISA的分离率为5.6 %。见表1，图1。

表1　12株hVISA在不同浓度万古霉素平皿中菌落形成单位Table 1 Colony-forming units of 12 hVISA strains in presence of different concentrations of vancomycin （CFU/mL）

图1　hVISA菌群分析/曲线下面积（PAP/AUC）图Figure 1 The population analysis profile - area under the curve for identifying hVISA strains

2.2BHIV平皿筛选结果

BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5筛选阳性菌株分别为：6、18、54、20株。

2.3BHIV平皿法灵敏度和特异度

以PAP/AUC方法为金标准计算4种含药平皿筛选法的灵敏度及特异度，见表2。

表2　4种检测方法对hVISA的灵敏度及特异度对比Table 2 The sensitivity and specificity of four methods in detecting hVISA strains

3　讨论

MRSA是医院感染重要的病原菌之一，万古霉素是目前治疗MRSA感染的首选药物，耐药发生率较低，但临床已出现应用万古霉素治疗MRSA感染失败病例，且引起广泛重视，其中hVISA的发现，可以解释万古霉素治疗失败率增加的原因。目前认为hVISA是VISA的前体，MRSA原代菌株对万古霉素敏感，MIC≤2 mg/L，但MRSA原代菌株分裂、繁殖后的菌株中却含有少量能够在≥4 mg/L BHIV平皿上生长的亚群，发生率为10-6，在治疗过程中，迫于万古霉素的压力这部分耐药亚群会逐渐发展为VISA，导致治疗失败。对hVISA感染检出率报道不一，1997-2000年来自亚洲12个国家的流行病学研究发现，在1 357株MRSA菌株中，hVISA检出率为4.3 %，其中来自中国的84株MRSA菌株未检出hVISA［8］。此后，国内对hVISA检出率陆续报道，2007年14个城市hVISA检出率为9.5 %［9］；部分省份中湖北地区hVISA检出率为17.8 %［6］，安徽地区的检出率为3.5 %［10］；本研究通过收集山东省12个地市15所三级医院临床菌株进行检测，用PAP/AUC方法作为金标准进行检测，最终证实本地区hVISA检出率为5.6 %，略低于全国平均水平，但必须引起足够重视。

目前实验室常规应用的纸片扩散法、平皿稀释法无法检测出hVISA，而且CLSI尚无针对hVISA标准的检测方法。虽然PAP/AUC法是检测hVISA的金标准，但该法需要特定的仪器及菌株，且较为耗时，无法作为常规检测在临床工作中开展。其他常见的检测方法还有含药琼脂平皿筛选法、宏量E试验法、E试验法等［11］，后两种方法操作较为简单，也有较高的灵敏度、特异度，但由于需要较多试纸，花费较高，无法作为常规检测方法在临床中推广应用。目前应用较多、首选的筛选方法仍为含药脑心浸液琼脂平皿筛选法。

随着2006年CLSI调整了MRSA对万古霉素的耐药折点，将万古霉素中介折点由8～16 mg/L调整为4～8 mg/L［12］。因此，初筛琼脂平皿万古霉素浓度也应当下调。

如何选择合适的药物浓度，使得筛选方法有较高的灵敏度及特异度。本研究选择BHIV6、BHIV4、BHIV2、BHIT5进行hVISA筛选，并以PAP/AUC法作为金标准，对比其灵敏度及特异度，观察最佳指标。研究发现，BHIV6特异度较高，达到99.0 %，但灵敏度较差，仅有41.7 %，可造成临床漏检。BHIV2虽然灵敏度得到了较大的提高，达 91.7 %，但假阳性数较高，特异度偏低，不利于临床治疗方案的调整。BHIV4和BHIT5结果显示有较高的灵敏度和特异度，上述两种平皿筛选方法检测结果与PAP/AUC最终确认方法较为一致，虽然灵敏度稍低，但特异度达到了90 %以上。这2种药物浓度可以作为hVISA首选的平皿筛选法。同时为了进一步提高检测方法的灵敏度，建议与其他检测方法如宏量E试验法等联合应用，期望尽可能达到PAP/AUC检测方法的效果，更好指导临床治疗MRSA感染。同时从研究结果上看，上述2种药物浓度由于假阳性数较少，因此将初筛结果再次用E试验检测时，试纸数量耗费不大，花费并不会太高，更容易被接受。

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Effect of updating vancomycin breakpoint for resistant Staphylococcus aureus on plate screening of hetero-resistant vancomycin intermediate Staphylococcus aureus

LIU Mingtao，LI Kaishu，LI Chao，OUYANG Xiuhe. （Department of Internal Medicine，Binzhou People's Hospital，Binzhou Shandong 256610，China）

Objective To examine the effect of updating vancomycin breakpoints for resistant Staphylococcus aureus on plate screening of hetero-resistant vancomycin intermediate Staphylococcus aureus （hVISA） to find a sensitive and effective plate screening method for detecting hVISA isolates. Methods A total of 215 clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）were collected. The hVISA isolates were identified on the brain heart infusion agar screening plates containing 6 mg/ L vancomycin （BHIV6），4 mg/L vancomycin （BHIV4），2 mg/L vancomycin （BHIV2） and 5 mg/L teicoplanin （BHIT5），respectively. Meanwhile，we also detected hVISA by the population analysis profile/area under the curve （PAP/AUC） method. The PAP/AUC method was taken as the gold standard. We calculated the sensitivity and specificity of BHIV6，BHIV4，BHIV2，BHIT5 screening methods as compared with PAP/AUC method. Results PAP/AUC method identified 12 hVISA strains from the MRSA. BHIV6，BHIV4，BHIV2，and BHIT5 plate screening methods identified 6，18，54，20 hVISA strains，respectively. The sensitivity of these four screening methods was 41.7 %，83.3 %，91.7 %，and 83.3 %，respectively. The corresponding specificity of these methods was 99.0 %，95.9 %，77.8 %，and 94.8 %，respectively. Conclusions After the vancomycin breakpoint for resistant S. aureus is updated，BHIV6 and BHIV2 screening methods are not so valid for detecting hVISA due to lower sensitivity or specificity. BHIV4 and BHIT5 screening methods are still valid for identifying hVISA strains with higher sensitivity and specificity.

Staphylococcus aureus； vancomycin resistance； laboratory technique and procedure

R378.11

A

1009-7708（2016）04-0455-05

10.16718/j.1009-7708.2016.04.013

山东省医药卫生发展计划（2014WS0310）。

山东省滨州市人民医院内科，山东滨州 256610 。

刘明涛（1984—） 男，医学硕士，主治医师，主要从事细菌耐药机制相关研究。

欧阳修河，E-mail：842764917@qq.com。

2015-08-23

2015-11-18