Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及Aβ蛋白表达检测

李　昱，宋贵军，辛世萌，林璐璐 ，曹云鹏

(1.大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116027；2.中国医科大学附属第一医院 神经内科，辽宁 沈阳 110001)



Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及Aβ蛋白表达检测

李昱1，宋贵军1，辛世萌1，林璐璐1，曹云鹏2

(1.大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116027；2.中国医科大学附属第一医院 神经内科，辽宁 沈阳 110001)

目的探讨Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及蛋白表达。方法18只12月龄BALB/c小鼠，随机分为3组，分别为Ad-Aβ(3-10)10-CpG组，空腺病毒载体组和Aβ1-42组，分别以Aβ3-10多价腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10) 10-CpG鼻黏膜免疫、空腺病毒载体鼻黏膜免疫、Aβ1-42肌内注射免疫。各组均每2周免疫1次，共免疫6次。ELISA法检测血清抗Aβ抗体滴度及亚型，免疫组化法检测免疫后的BALB/c小鼠抗血清能否与转基因鼠脑内Aβ斑块结合，免疫组化法检测鼻黏膜内Aβ蛋白的表达。结果Ad-Aβ(3-10) 10-CpG组和Aβ1-42组抗体滴度随着免疫次数逐渐增加。6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG组血清中抗Aβ抗体滴度为(83.71±16.69)μg/mL，明显高于空载体组(P<0.01)，而低于Aβ1-42组(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组的IgG1/ IgG2a比值分别为10.85±2.02和1.95±1.82，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组IgG1/IgG2a比值明显高于Aβ1-42组(P<0.05)。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组小鼠的抗血清能和转基因鼠脑内的Aβ斑块结合。Ad-Aβ(3-10) 10-CpG组鼻黏膜内可以检测到Aβ蛋白表达，而其他各组小鼠鼻黏膜内未检测到Aβ蛋白表达。结论Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫主要产生Th2型免疫应答，减少了由T细胞介导的免疫应答引起的炎症反应。

阿尔茨海默病；腺病毒载体疫苗；免疫原性；Aβ

[引用本文]李昱，宋贵军，辛世萌,等.Aβ3-10多价腺病毒疫苗鼻黏膜免疫BALB/c鼠的免疫原性鉴定及Aβ蛋白表达检测[J].大连医科大学学报，2016,38(4)：320-325.

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是导致老年期痴呆的最常见原因。AD的主要病理改变为老年斑和神经原纤维缠结形成，淀粉样蛋白(amyloid β, Aβ)是老年斑的主要成分。人体淀粉样蛋白前体蛋白(APP)在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下产生Aβ，其中主要为Aβ1-42，AD患者Aβ1-42增多。目前认为有神经毒性的Aβ聚集是AD发生和进展的始动因素[1]。所以AD的治疗研究主要集中在减少脑内Aβ蛋白沉积和阻断病理形式Aβ蛋白形成。针对Aβ蛋白的免疫治疗可以减少脑内淀粉样斑块沉积，并改善转基因鼠学习和记忆能力[2]。但临床试验由于6%的病人出现了中枢神经系统炎症而被迫停止[3]。这种副作用确切原因不清楚，但是推测与Aβ的T细胞抗原决定簇特异性的T细胞反应或传统佐剂QS21有关[4]，后续的主动免疫研究集中在改变免疫原和佐剂来克服不恰当的T细胞应答引起的中枢神经系统炎症。研究表明在小鼠和人中Aβ分子的B细胞抗原决定簇定位在Aβ1-15[5-6]，T细胞抗原决定簇定位在Aβ的中间区域和C末端[5]。Zago等[7]发现只有针对Aβ的N末端的抗体可以使脑内淀粉样斑块清除。针对Aβ的N末端的DNA疫苗可以改善转基因鼠认知功能，促进Aβ斑块清除，减少脑内炎症反应[8-9]。

本研究前期工作已成功构建编码10次重复N末端片段Aβ3-10和CpG序列的新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG[10]。本研究用该腺病毒载体疫苗通过鼻黏膜吸入的途径来免疫BALB/c鼠，检测血清抗Aβ抗体滴度及抗体分型，抗体的功能，鼻黏膜Aβ蛋白表达，来检测基因重组腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG的免疫原性及体内Aβ蛋白表达，为下一步转基因鼠实验提供基础。

1　材料和方法

1.1材料

18只BALB/c小鼠均为12月龄，雄性，1只12月龄的APPswe/PSEN1dE9转基因鼠(表达鼠/人嵌合的淀粉样蛋白前体和突变的人早老素1，这两种突变与早发性AD相关)，雄性，购自中国医科大学动物部。随机分为3组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 组、空毒载体组、Aβ1-42组(阳性对照组)，每组6只。所用试剂：Aβ1-42多肽(AnaSpect)，完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，不完全弗氏佐剂(Sigma，USA)，小鼠单克隆抗体(Covance，USA)，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)，鼠SP检测试剂盒(ZAGB-BIO)，Human Aβ42 ELISA kit (invitrogen)，6E10抗体(Signet，MA)。

1.2方法

1.2.1免疫方法：Ad-Aβ(3-10)10-CpG组：Ad-Aβ(3-10)10-CpG 10 μL(1×108PFU)鼻腔免疫；空载体组：空腺病毒载体10 μL(1×108PFU)鼻腔免疫；Aβ1-42组：免疫方法参照[2]，Aβ1-42肽干粉1 mg溶于70 μL 1%NH4OH中，再加入430 μL PBS，混匀，每50 μL 分装。接种前放置37 ℃ 孵育过夜，第1次免疫用50 μL(100 μg)+完全性弗氏佐剂50 μL，股四头肌肌内注射，第2次及以后免疫用Aβ1-42肽 50 μL(100 μg)+不完全性弗氏佐剂50 μL，股四头肌肌内注射。各组均每2周免疫1次，共免疫6次。

1.2.2血清及脏器标本采集：每组小鼠免疫前及第2次到第6次免疫后7天采血，经眶静脉采血，每次采血量约为0.2～0.3 mL；最后一次免疫后2周小鼠处死，经髂静脉及心脏采血，量约1.5 mL。全血室温下静置2～3 h，10000 r/min，10 min 离心，留取血清，分装，-70 ℃ 保存。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组、空载体组留取3只小鼠的鼻子，放入含有EDTA的75%乙醇-甲醛中脱钙固定3周。

1.2.3ELISA 法测血清抗Aβ 抗体滴度和亚型：ELISA法检测免疫前及第2次到第6次免疫后7天的血清中抗Aβ抗体水平。用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6，0.05 mol/L)将Aβ1-42肽稀释至5 μg/mL，在96孔酶标板每个孔中加0.1 mL，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(含0.05%TW20的1×PBS)洗板3次。每孔中加入封闭缓冲液(含0.5%BSA，5%羊血清，0.05%TW20的1×PBS)200 μL，室温孵育1 h。弃去孔中液体，向孔中加入标准抗体6E10(标准抗体浓度分别为10 ng/mL，7.5 ng/mL，5 ng/mL， 2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.625 ng/mL，0 ng/mL)和待测血清(血清稀释500～3000倍)50 μL，置于37 ℃孵育1.5 h。弃去血清和抗体，用洗涤缓冲液洗板3次。于各孔中加入稀释羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶1000稀释)，IgG1-HRP(1∶500稀释)，IgG2a-HRP(1∶500稀释), IgG2b-HRP(1∶500稀释) 0.1 mL，置于37 ℃ 孵育1 h。弃去二抗，洗板5次。于各孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，置于37 ℃ 孵育20 min。于各反应孔中加入0.5 mol/L硫酸0.1 mL。用酶标仪检测450 nm处各孔吸光度(OD)值，绘制标准曲线，求得各待测血清中的抗Aβ 抗体浓度。

1.2.4抗血清对转基因鼠脑中淀粉样斑块免疫反应性的检测：1只12月龄的APPswe/PSEN1dE9转基因鼠处死，右侧大脑半球以75%乙醇-甲醛固定，常规石蜡包埋，冠状位切片，厚度约为4 μm。常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min→100%酒精Ⅰ5 min→ 100%酒精Ⅱ5 min→95%酒精5 min→80%酒精5 min→75%酒精5 min，蒸馏水洗5次。3%双氧水37 ℃，孵育10 min，以阻断灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次5 min。置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修复，自然冷却20 min以上，冷水冲洗，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加正常羊血清工作液封闭，37 ℃，10 min。滴加一抗，分别滴加Ad-Aβ(3-10)10-CpG组小鼠免疫前，6次免疫后的血清，Aβ1-42组6次免疫后血清，空载体组6次免疫后血清，4 ℃过夜。滴加生物素标记相应的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木素复染5 min，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。

1.2.5鼻黏膜中Aβ蛋白表达的检测：免疫治疗后1周，将用含EDTA的75%乙醇-甲醛中脱钙固定后的Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和空载体组小鼠的鼻子常规石蜡包埋，按平行鼻腔长轴方向切片，厚约4 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%双氧水37 ℃孵育10 min以阻断灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中煮沸5 min以抗原修复，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5 min；正常羊血清工作液封闭，37 ℃，10 min，倾去勿洗；检测小鼠鼻黏膜Aβ表达，滴加6E10抗体(1∶500 稀释)，滴加生物素标记相应的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木素复染5 min，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片。

1.3统计学方法

各组数据用均数±标准差表示。应用SPSS16.0软件，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1血清抗Aβ抗体滴度及分型

各组免疫前的血清未检测到抗Aβ抗体，随着免疫次数增加，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组抗体滴度逐渐增加，而空载体组抗体滴度一直呈基线水平。第6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组血清中抗Aβ抗体滴度平均值分别为(83.71±16.69)μg/mL和(103.5±18.94)μg/mL，明显高于空载体组(P<0.01)；Ad-Aβ(3-10)10-CpG组血清抗Aβ抗体滴度低于Aβ1-42组(P<0.05)。见图 1。将Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组第6次免疫后的血清进行抗体亚型分析。产生的抗体有IgG1，IgG2a，IgG2b，Ad-Aβ(3-10)10-CpG组产生的抗体主要为IgG1，IgG1/ IgG2a比值为10.85±2.02；Aβ1-42组的IgG1/IgG2a比值为1.95±1.82。Ad-Aβ(3-10)10-CpG组IgG1/IgG2a比值明显高于Aβ1-42组(P<0.05)。见图 2。

图1　免疫过程中各组小鼠血清中抗Aβ抗体滴度变化Fig 1 Anti-Aβ antibody titers in the sera of mice of three groups　　　与空载体组比较，* P<0.05，** P<0.01；# 与Aβ1-42组比较，P<0.05

图2　血清抗Aβ抗体亚型分析Fig 2 Isotype analysis of anti-Aβ antibodyA：第6次免疫后血清抗Aβ抗体的IgG1，IgG2a，IgGb亚型；B：IgG1/IgG比值。*与Aβ1-42组比较，P<0.05

2.2抗血清和转基因鼠脑内淀粉样斑块结合反应

6次免疫后Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组小鼠的抗血清都能和转基因鼠脑内的Aβ斑块结合，而Ad-Aβ(3-10)10-CpG组免疫前的血清和空载体组的血清不能与转基因鼠脑内的Aβ斑块结合而使其显色(图3)。

图3　小鼠血清与转基因鼠脑内Aβ斑块结合反应Fig 3 The reaction of sera from each group to Aβ plaques in brain of transgenic mice (APPswe/PSEN1dE9)　　A：Ad-Aβ(3-10)10-CpG组免疫前血清；B：Aβ1-42组抗血清；C：Ad-Aβ(3-10)10-CpG组抗血清；D：空载体组血清。B和C能与转基因鼠脑内Aβ斑块结合；A和D不能与Aβ斑块结合。图中比例尺代表100 μm

2.3Aβ蛋白在鼻黏膜中的表达

免疫治疗后1周Ad-Aβ(3-10)10-CpG组小鼠鼻腔上皮细胞可以观察到被Aβ抗体染成棕色的Aβ蛋白表达，而空载体组小鼠未观察到Aβ蛋白表达(图4)。

3　讨　论

研究表明，包含Aβ N末端片段的肽类疫苗[11]，和基因疫苗[9,12-13]可以有效减轻AD样病理改变，而不会引起中枢神经系统T细胞浸润。Mclaurin等[6]分析Aβ肽N末端多个小肽段认为Aβ4-10是与抗Aβ抗体结合的最小肽段，Aβ3-6为抗Aβ积聚的抗原决定簇，缺少3号位氨基酸时其与抗Aβ抗体的亲和性明显降低。因此，本研究选择Aβ3-10作为的腺病毒疫苗编码的抗原。在人类，CpG序列直接刺激B细胞和浆细胞样树突状细胞。CpG序列可以用作疫苗的佐剂，来增加疫苗特异性免疫应答的速度，程度和持续时间[14]。有研究发现，包含CpG序列的空载体可以减轻自身免疫性脑膜炎[15]。CpG-ODN作为佐剂可以增强DNA初始-蛋白加强免疫策略时大鼠体内抗Aβ抗体的产生，而且产生的免疫反应为Th2型[16]。所以，本组前期研究将Aβ的N末端片段缩小到Aβ3-10并重复10次，以CpG序列为佐剂，构建新型腺病毒疫苗Ad-Aβ(3-10)10-CpG，并通过测序验证[10]。

图4　免疫后1周Ad-Aβ(3-10)10-CpG组小鼠鼻腔上皮细胞Aβ蛋白表达Fig 4 Expression of Aβ in nasal epithelial cells one week after immunization　　A：良好分化的柱状上皮；B：上皮损坏暴露的立方形、基底样细胞。均检测到被Aβ抗体染成棕色的Aβ蛋白表达。比例尺代表50 μm

本研究发现Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗鼻黏膜免疫可以在鼻黏膜表达Aβ蛋白。腺病毒疫苗鼻黏膜免疫7天后，可以在嗅球，嗅神经细胞层，嗅神经纤维观察到转基因蛋白的表达[17]。腺病毒载体可以通过鼻黏膜的嗅神经细胞逆行性转运至中枢神经系统。Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗鼻黏膜免疫可以在鼻黏膜上皮表达Aβ蛋白，也可以通过相同途径入脑，诱导体内产生抗Aβ抗体，进而清除脑内Aβ斑块。

本研究中Ad-Aβ(3-10)10-CpG 组6次免疫后产生的抗Aβ抗体滴度明显高于空载体组，但是低于Aβ1-42组，这与以往的基因疫苗研究结果相似[18]。免疫球蛋白亚型间接反映免疫应答中产生的细胞因子，Th2细胞因子主要诱导IgG1产生，Th1细胞因子主要诱导IgG2a产生[18]。从免疫球蛋白IgG亚型分析可以看出，Ad-Aβ(3-10)10-CpG 组主要产生的抗体为IgG1型，说明主要产生Th2型免疫应答，而Aβ1-42组同时产生IgG1和IgG2a型，说明同时产生了Th1和Th2型应答。所以Ad-Aβ(3-10)10-CpG与Aβ42疫苗相比引起Th1免疫应答相关的脑内炎症反应可能性更小，更安全。而且，既往研究也表明IgG1比IgG2a和IgG2b清除脑内Aβ斑块更有效[19]。

研究表明，抗Aβ抗体阻止Aβ聚集或促进Aβ解聚是通过直接与Aβ沉积结合破坏β片层结构而引起斑块解聚[20]，进一步与可溶性Aβ结合来保护突触功能并减少Tau蛋白磷酸化[7]。本研究中Ad-Aβ(3-10)10-CpG组和Aβ1-42组免疫后的抗血清能与转基因鼠脑内的Aβ斑块结合，说明Ad-Aβ(3-10)10-CpG疫苗产生的抗体能够促进脑内Aβ斑块清除，对AD有治疗作用。

综上所述，Ad-Aβ(3-10)10-CpG鼻黏膜免疫BLAB/c鼠可以诱导Th2型免疫反应，不引起明显的炎症反应，因此Ad-Aβ(3-10)10-CpG是一种安全有效的治疗AD的候选疫苗。

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Identification of the immunogenicity of multivalence Aβ3-10adenovirus vaccine and expression of Aβ in nasal mucosal in BALB/c mice

LI Yu1, SONG Gui-jun1, XIN Shi-meng1, LIN Lu-lu1, CAO Yun-peng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China；2.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To identify the immunogenicity of the multivalence Aβ3-10adenovirus vaccine and to detect the expression of Aβ in nasal mucosa of the BALB/c mice. Methods Eighteen twelve-month old BALB/c mice were divided into three groups, Ad-Aβ(3-10)10-CpG group, empty vector group and Aβ1-42group. They were immunized with recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG by intranasal inoculation, with intranasal inoculation empty adenoviral vector and with intramuscularly injection Aβ1-42, respectively. Titers of anti-Aβ antibody and isotypes of immunoglobin in sera were determined with ELISA. The immunoreactivity of antisera to amyloid plaque and the expression of Aβ in nasal mucosal were detected by immunohistochemistry. Results Sera from Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42group showed a steady increase in anti-Aβ antibody titer with each boost. The average anti-Aβ antibody titer in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group (83.71±16.69)μg/mL after six times of immunization was greater than that in empty vector group(P<0.01)and lower than that in Aβ1-42group(P<0.05). IgG1/IgG2a ratio was 10.85±2.02 in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and 1.95±1.82 in Aβ1-42group(P<0.05). Sera from Ad-Aβ(3-10)10-CpG group and Aβ1-42group was able to bind to Aβ plaques in brain sections of transgenic mouse. Expression of Aβ in the nasal mucosa was observed in Ad-Aβ(3-10)10-CpG group, while not in other groups. Conclusions Intranasal inoculation with the recombinant adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG could induce Th2-polarized immune response in the wild-type mice. The adenovirus vaccine Ad-Aβ(3-10)10-CpG had low potential to cause T cell-mediated autoimmune response. This could provide the basis for the next step researches in transgenic mice.

Alzheimer's disease; adenovirus vaccine; immunogenicity； β-amyloid

国家自然科学基金项目(81371227)

李 昱(1983-)，女，黑龙江齐齐哈尔人，主治医师。E-mail: liyu_cmu@hotmail.com

曹云鹏，教授。E-mail: ypengcao@yahoo.com

论著10.11724/jdmu.2016.04.02

R741.05

A

1671-7295(2016)04-0320-06

2016-06-13；

2016-07-06)