冬凌草甲素对甲状腺癌BCPAP细胞增殖的抑制作用

杨丹丽，张迎秋，李　媛，秦胜堂

(大连医科大学 肿瘤干细胞研究院，辽宁 大连 116044)



冬凌草甲素对甲状腺癌BCPAP细胞增殖的抑制作用

杨丹丽，张迎秋，李媛，秦胜堂

(大连医科大学 肿瘤干细胞研究院，辽宁 大连 116044)

目的研究冬凌草甲素对甲状腺癌BCPAP细胞增殖的抑制作用。方法使用0、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L浓度的冬凌草甲素处理甲状腺癌细胞株BCPAP 48 h后，用CCK8测定细胞增殖率，绘制增殖曲线，计算细胞半数抵制率(IC50)。实验组加入接近IC50浓度(10 μmol/L)的冬凌草甲素，对照组细胞正常培养36 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡，利用Western blot检测凋亡基因PARP、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表达。结果冬凌草甲素能显著抑制BCPAP细胞增殖，在2～20 μmol/L时，具有明显的量效关系。流式细胞术检测发现，与对照组相比，实验组细胞早期凋亡率(2.83±0.70)%，晚期凋亡率(1.43±0.31)%，总凋亡率(4.27±1.01)%，均明显升高(P<0.05)。Western blot发现，剪切后的PARP及p-Erk蛋白的表达水平分别上调了1.5倍和1.8倍，上调显著(P值均<0.05)。结论冬凌草甲素可抑制甲状腺癌细胞株BCPAP增殖，其可能与诱导细胞凋亡有关。

冬凌草甲素；甲状腺癌细胞株BCPAP；细胞增殖；细胞凋亡

[引用本文]杨丹丽，张迎秋，李媛,等.冬凌草甲素对甲状腺癌BCPAP细胞增殖的抑制作用[J].大连医科大学学报，2016,38(4)：330-333.

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌症中最常见的组织类型，是典型的分化良好型肿瘤，治愈率高而且预后良好[1-2]。然而侵袭性甲状腺乳头状肿瘤和一些该肿瘤的变异型仍会导致10%左右的病人10年内病情复发和肿瘤转移，所以尽管乳头状甲状腺癌分化良好[3]，但仍能发生转移而且存在一定的抗药性，因此针对这种恶性肿瘤的治疗方法还需要突破[4]。近期文献报道冬凌草甲素具有极强的抗肿瘤作用[5-7]，但是它对于甲状腺癌的作用少有报道。本研究拟探讨冬凌草甲素对甲状腺癌细胞株BCPAP增殖的影响,希望为甲状腺癌的相关治疗提供帮助。

1　材料和方法

1.1主要试剂与仪器

冬凌草甲素标准品购自大连美仑生物技术有限公司；人甲状腺癌BCPAP细胞株为大连医科大学肿瘤干细胞研究院刘强课题组惠赠；细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物；冬凌草甲素用1 mL DMSO溶解后加入9 mL ddH2O，配制成含10%DMSO浓度为10 mmol/L的储液，4 ℃保存，使用时用培养基稀释成相应浓度，对照组为含相应含量DMSO的培养基。

1.2细胞培养

培养所需DMEM培养基、胰酶和胎牛血清均购自Gibco公司。

细胞培养条件为37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。0.05%胰酶消化传代。

1.3CCK8测定细胞增殖率

取对数生长期细胞，以5×104/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，过夜培养使细胞贴壁。24 h后分别新鲜加入含0(对照组)、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L冬凌草甲素的培养基100 μL，继续培养48 h，吸弃培养基，按照试剂盒说明书向每孔中加入10 μL CCK8溶液。将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。将各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加10 μL CCK8溶液，无细胞)后，计算细胞增殖率：增殖率=OD实验组/OD对照组×100%。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡

使用凯基生物的Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，调整细胞浓度为1.5×105/mL，将细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔2 mL，培养过夜使细胞贴壁吸弃培养基，实验组加入含10 μmol/L冬凌草甲素的培养液2 mL，对照组加入含0.2 μLDMSO的培养液2 mL，培养36 h。0.05%胰酶消化后，取(1～5)×105个重悬的细胞1000 g离心5 min后弃上清，按说明书分别加入500 μL binding buffer重悬，5 μL Annexin V轻轻混匀，及5 μL PI混匀，室温避光反应15 min，进行流式细胞仪检测。

1.5Western blot实验

收集相应10 μmol/L冬凌草甲素处理36 h的实验组细胞和DMSO处理36 h的对照组细胞裂解提取蛋白。以10%SDS-PAGE胶分离蛋白，然后转移膜。5%脱脂奶粉封闭后分别以不同的抗体(DNA修复酶PARP/细胞外调节蛋白激酶erk1/2及p-erk1/2，根据抗体说明书1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜，洗去一抗后，以辣根过氧化物酶(HRP)连接的二抗室温孵育1 h，洗涤，ECL试剂盒显示条带，β-actin作为内参。

1.6统计学方法

2　结　果

2.1冬凌草甲素对BCPAP细胞体外增殖作用的影响

冬凌草甲素作用于BCPAP细胞系48 h后，细胞增殖率曲线可见冬凌草甲素浓度在2～20 μmol/L时，浓度越高细胞增殖率越低，具有明显的量效关系。见图1。其细胞半数抑制率(IC50)为10.49 μmol/L，随着冬凌草甲素浓度的进一步增加，BCPAP细胞系的增殖率明显下降，最终接近于停止。

图1　不同浓度冬凌草甲素(0～100 μmol/L)作用于BCPAP细胞48 h后的增殖曲线Fig 1 The proliferation curve of different concentrations of Oridonin (0-100 μmol/L)on BCPAP cell after 48 h

2.2流式细胞仪结果分析

流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，实验组早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均升高(t分别为18.59,4.61,12.87)，尤其是早期凋亡组变化更为显著，差异均有显著性意义(P<0.05)。见表1，图2。

表 1冬凌草甲素对BCPAP细胞凋亡的影响

Tab 1 Effect of oridonin inducing apotosis of BCPAP cells(%)

早期凋亡率晚期凋亡率总凋亡率对照组2.83±0.701.43±0.31 4.27±1.01实验组34.87±3.031)4.40±0.661)39.27±3.611)

1)与对照组比较，P<0.05

图2　冬凌草甲素对BCPAP细胞凋亡的影响Fig 2 Oridonin induces the apoptosis of BCPAP cellsA:对照组；B:实验组

2.3PARP和Erk1/2的表达

Western blot结果显示，与对照组相比，实验组被剪切PARP和磷酸化Erk1/2的表达上调，根据灰度值比较分析，剪切后的PARP及p-Erk的表达水平分别上调了1.5倍和1.8倍，上调显著(P值均<0.05)。见图3。

图3　凋亡相关蛋白表达水平Fig 3 Expression levels of apoptosis-related proteins

3　讨　论

冬凌草甲素是植物冬凌草中的一种四环二萜化合物，是冬凌草中的主要活性成分[8]。近年来中药活性成分治疗肿瘤成为研究的热点之一[9]。已有许多文献报道冬凌草甲素对多种肿瘤具有杀伤作用[10-11]，但是它对于甲状腺癌的作用还无从得知。本研究发现冬凌草甲素可显著抑制甲状腺癌BCPAP细胞株的增殖，诱导其凋亡。

本研究采用不同浓度的冬凌草甲素作用于BCPAP细胞48 h，发现浓度在2～20 μmol/L时，随着浓度的增加，冬凌草甲素对BCPAP的增殖抑制作用增强，具有明显的浓度依赖性。采用接近IC50的浓度(10 μmol/L)进行后续研究，探讨冬凌草甲素抑制细胞增殖的机制。

本研究采用流式细胞术AV-PI双染的方法检测了冬凌草甲素作用于甲状腺癌细胞株BCPAP 36 h后细胞凋亡比率。结果发现，与对照组相比，实验组细胞凋亡比例显著升高，尤其早期凋亡的比例更为显著，这提示冬凌草甲素可能是通过诱导细胞发生早期凋亡来抑制增殖。本研究利用western blot检测了冬凌草甲素作用后，凋亡相关蛋白及通路核心分子的变化。结果表明冬凌草甲素的加入明显上调了被剪切PARP及p-Erk的蛋白水平，而并不改变total Erk的蛋白表达，这与Erk磷酸化之后发挥信号转导作用是一致的。这一结果有助于进一步探讨其作用机制。

总之，本研究显示冬凌草甲素可抑制甲状腺癌BCPAP细胞增殖，其机制可能是通过诱导细胞凋亡[12]。今后将进一步深入探讨其对肿瘤抑制作用的机制和对细胞周期的影响，为甲状腺癌的临床治疗提供实验基础。

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Study of Oridonin inhibiting proliferation of thyroid carcinoma cell line BCPAP

YANG Dan-li, ZHANG Ying-qiu, LI Yuan, QIN Sheng-tang

(InstituteofCancerStemCell,DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China)

Objective To investigate the mechanism of Oridonin on proliferation of BCPAP thyroid carcinoma. Methods Thyroid carcinoma cell line BCPAP was treated 48 h with Oridonin. CCK8 method was used to detect cell proliferation rate, flow cytometry used in apoptosis analysis and western blot method used to detect PARP and Erk1/2 expression. SAS 9.3 software was used in statistical analysis. Results Oridonin inhibited proliferation of BCPAP thyroid carcinoma significantly and had dose-dependent in middle-level concentration (2-20 μmol/L).The cells treated with oridonin showed higher apoptosis frequency than those non-treated (P<0.05). Spliced PARP and p-Erk1/2 expression increased in cells treated with oridonin. Conclusion Oridonin would inhibit proliferation of BCPAP by induction cell apoptosis.

Oridonin; thyroid carcinoma cell line BCPAP; cell proliferation; cell apoptosis

杨丹丽(1987-)，女，河南商丘人，助理实验师。E-mail：ydanli963@163.com

秦胜堂，助理实验师。E-mail：qinlang8188@163.com

论著10.11724/jdmu.2016.04.04

R736.1

A

1671-7295(2016)04-0330-04

2015-12-05;

2016-04-06)