miR-499-5p调控AKT2基因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和迁移的影响

宋文金，沈喜玉，李　季，毕　岩

(盘锦市中心医院 骨外科，辽宁 盘锦 124000)



miR-499-5p调控AKT2基因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和迁移的影响

宋文金，沈喜玉，李季，毕岩

(盘锦市中心医院 骨外科，辽宁 盘锦 124000)

目的探讨miR-499-5p在骨肉瘤MG63细胞中的表达及其对MG63细胞凋亡和迁移的影响。方法运用生物信息学软件TargetScan和miRanda对miR-499-5p和AKT2基因的靶向配对关系进行预测。未转染细胞设为空白对照组(control组)，脂质体2000转染miR-499-5p模拟物为mimics组，转染干扰AKT2基因的siRNA为siRNA组。 Real-time PCR检测3组细胞中miR-499-5p和AKT2 mRNA的表达情况，western blot检测AKT2蛋白的表达情况，流式细胞术检测3组细胞凋亡情况，细胞划痕实验检测体外的迁移情况。结果TargetScan和miRanda显示miR-499-5p和AKT2基因二者靶向配对良好。Real-time PCR检测结果表明转染mimics后，AKT2 mRNA的表达量降至(45.06±8.12)%，与control组(100%)比较，差异有显著性意义(P<0.05)。Western blot检测结果表明mimics组AKT2蛋白相对表达量为(0.32±0.05)，与comtrol组(0.69±0.11)比较，明显降低，P<0.05。流式细胞术和细胞划痕实验结果显示mimics组MG63细胞凋亡率(18.97±2.41)%及细胞划痕愈合率(63.54±5.43)%，与control组(10.35±2.56)%和(90.35±6.81)%相比差异均有显著性意义(P<0.05)。结论miR-499-5p能够下调骨肉瘤MG63细胞中AKT2基因的表达，促进癌细胞的凋亡以及抑制细胞的迁移。

微小RNA；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2；骨肉瘤MG63细胞

[引用本文]宋文金，沈喜玉，李季，等.miR-499-5p调控AKT2基因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和迁移的影响[J].大连医科大学学报，2016,38(4)：326-329，333.

骨肉瘤是常见的原发骨组织恶性肿瘤，约占骨原发肿瘤的 20%，恶性程度高。近年来，随着外科保肢技术的发展以及新的辅助化疗方案的应用，骨肉瘤的治疗已取得了显著的进步。但是，由于骨肉瘤具有高度的侵袭性以及容易转移，骨肉瘤患者的预后比较差，死亡率仍然较高。因此，认识骨肉瘤发生进展的机制显得极为重要。MicroRNA(miRNA)是一类非编码RNA，长度大约为21～25 nt，通过与靶基因mRNA 3' 端非翻译区(3' UTR)互补，降解目的基因并下调其表达[1]，以此参与疾病发生过程中基因表达的调控。AKT是一种对细胞代谢、增殖和迁移等生命活动有重要功能的蛋白激酶，能够磷酸化丝氨酸/苏氨酸[2]。AKT2是其亚型之一，它的高表达能使细胞发生恶性转化，与人类多种肿瘤(如：甲状腺癌、卵巢癌和胃癌等)的发生和发展有密切关系[3-5]。

本研究运用生物信息学方法对miR-499-5p和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Serine-threonine kinase，AKT)基因的靶向配对关系进行预测，转染miR-499-5p模拟物以及干扰AKT2基因的siRNA后， 检测miR-499-5p和AKT2 mRNA在癌细胞中的表达，阐明其对MG63细胞凋亡和迁移的影响。

1　材料和方法

1.1材料

DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibico公司，反转录试剂盒、RNAiso for small RNA和SYBR Premix Ex TaqTMII购自TaKaRa公司，脂质体 2000购自Invitrogen公司，miR-499-5p mimics购自GenePharma公司，siRNA购自Dharmacon公司，兔抗人AKT2抗体购自Santa Cruz公司，骨肉瘤MG63细胞购自上海生物细胞研究所。

1.2生物信息学方法预测

运用miRNA生物信息学软件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和miRanda (http://www.microrna.org/) 对miR-499-5p和AKT2(NM_001626)基因的靶向配对关系进行预测。

1.3细胞培养与转染

MG63细胞37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换一次液。待细胞达到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并传代。应用脂质体2000 转染 miR-499-5p 模拟物(mimics组)或干扰AKT2基因的siRNA 30 nmol/L(siRNA组)进入细胞，24 h 后进行后续实验，未转染组设为空白对照组(control组)。

1.4Real-time PCR检测

取control、siRNA以及mimics 3组细胞，分别加入Trizol 或RNAiso for small RNA提取总mRNA或总miRNA，运用反转录试剂盒反转录为cDNA，稀释后加入SYBR Premix Ex TaqTMII和引物(表1)40 个循环的PCR 反应，并对反应结果进行定量分析。

表1　引物序列

1.5 Western blot检测

取control、siRNA以及mimics 3组细胞，分别加入RIPA裂解液充分震荡后，超声破碎，4 ℃离心20 min，采用BCA法测定样品总蛋白量。取15 μL样品SDS-PAGE分离后转膜，应用4%BSA封闭1 h，加入兔抗人AKT2抗体(1∶200)，4 ℃过夜后，滴加二抗(1∶800)，4 ℃摇床1 h后凝胶成像系统ECL发光显影。

1.6流式细胞术

取control、siRNA以及mimics 3组细胞，PBS 冲洗细胞 3 次，并用 0.25%胰蛋白酶消化，弃去上清液，PBS 冲洗1次，将细胞重悬于冷PBS 中，加入FITC标记annexin-V和0.02 mg/mL碘化丙啶，室温下避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测。

1.7细胞划痕实验

将control、siRNA以及mimics 3组细胞分别接种于 6 孔板中，待细胞完全融合，移除培养基并用枪头做十字划线，更换新鲜的无血清培养基，并拍照，记为0 h。24 h后，在同一处拍照，记为24 h。

1.8统计学方法

2　结　果

2.1miR-499-5p和AKT2基因靶向配对关系

TargetScan显示miR-499-5p在AKT2 3′UTR上有一个脊椎动物间保守的靶位点，其类型为8mer，匹配得分为96。miRanda结果表明miR-499-5p与靶位点的mirSVR 得分为-0.4184。见表2。

表2　 miR-499-5p 与AKT2 基因靶向配对关系

2.2 miR-499-5p和AKT2 mRNA的表达情况

Real-time PCR检测结果显示control组miR-499-5p的表达量设为1，则转染组(mimics)是其(22.64±6.58)倍，差异有显著性意义(P<0.05)(图1a)。control组AKT2 mRNA的表达量设为100%， 转染siRNA后其表达量下降为(41.37±6.52)%，转染mimics后其表达量也降至(45.06±8.12)%，两组与control组相比差异均有显著性意义(P<0.05)(图1b)。

图1　miR-499-5p和AKT2 mRNA的表达量Fig 1 Relative expression level of miR-499-5p and AKT2 mRNA a：miR-499-5p表达量；b：AKT2 mRNA表达量。*与control组比较, P<0.05

2.3AKT2蛋白的表达情况

Western blot检测各组AKT2蛋白表达应用软件扫描条带灰度值，结果显示mimics组和siRNA沉默AKT2组(siRNA组)AKT2蛋白相对表达量[(0.32±0.05)和(0.23±0.03)]较control组(0.69±0.11)明显降低，差异有显著性意义(P<0.05)。见图2。

2.4miR-499-5p对MG63细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示siRNA组和mimics组MG63细胞凋亡率[(19.86±2.34)% 和(18.97±2.41)%]均较control组(10.35±2.56)%明显升高，差异有显著性意义(P<0.05)。见图3。

2.5 miR-499-5p对MG63细胞迁移的影响

图2　各组细胞AKT2 蛋白的表达Fig 2 AKT2 protein expression in three groups

图3　流式细胞术检测MG63细胞的凋亡Fig 3 The apoptosis of MG63 cells by flow cytometry

细胞划痕实验结果显示24 h后control组细胞划痕愈合率(90.35±6.81)%明显快于siRNA组(48.63±4.95)%和mimics组(63.54±5.43)%，差异有显著性意义(P<0.05)。见图4。

图4　细胞划痕实验检测MG63细胞的迁移Fig 4 The migration of MG63 cells by the wound healing assay

3　讨　论

Liu JF等[6]研究发现PIK3CA蛋白的高表达能够激活PI3K/AKT通路促进胃癌细胞的增殖和远处转移，肿瘤细胞分化程度越低，临床分期越晚，AKT2蛋白的阳性表达率就越高。近年来有研究发现AKT2与骨肉瘤的发生进展有着密切关系[7-8]，但是相关研究并不多，本研究应用Real-time PCR和Western blot发现骨肉瘤MG63细胞内有AKT2 mRNA和蛋白的高表达，推测其与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关。

MicroRNA作为非编码RNA被证实与骨肉瘤密切相关[9-11]。Li Y等[12]研究发现miR-34a、miR-143、miR-145和miR-200b在骨肉瘤细胞中低表达，在骨肉瘤细胞系中过表达miR-34a和miR-200b，其可以通过调控Notch-1传导通路抑制骨肉瘤细胞的生物学行为。Ezrin蛋白是细胞骨架与细胞膜之间的连接蛋白，参与微绒毛的形成并与细胞形态的维持、运动、黏附及生存有关。Zhu J等[13]研究发现miR-183可以通过靶向抑制Ezrin蛋白，进而抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

本研究运用生物信息学方法对miR-499-5p和AKT2基因的靶向配对关系进行预测，发现二者配对良好，脂质体2000转染miR-499-5p模拟物以及干扰RNA后，Real-time PCR和Western blot检测结果均表明过表达miR-499-5p能够降低AKT2 mRNA和蛋白的表达。进一步应用流式细胞术检测癌细胞的凋亡情况，细胞划痕实验检测癌细胞体外的迁移情况，发现过表达miR-499-5p能够促进MG63细胞的凋亡以及抑制细胞的迁移。由此可以得出，miR-499-5p能够下调骨肉瘤MG63细胞中AKT2基因的表达，促进癌细胞的凋亡以及抑制细胞的迁移。

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Role of miR-499-5p in osteosarcoma MG63 cells apoptosis and migration by regulating AKT2 expression

SONG Wen-jin, SHEN Xi-yu, LI Ji, BI Yan

(DepartmentofOrthopedic，CentralHospitalofPanjinCity,Panjin124000,China)

Objective To identify expressions of miR-499-5p and AKT2 in osteosarcoma MG63 cells and explore the role of miR-499-5p on cell apoptosis and migration which may regulate AKT2 expression. Methods It was predicted by bioinformatics that miR-499-5p may regulate AKT2 expression. After transfection of miR-499-5p mimics or siRNA into cells, the expressions of miR-499-5p and AKT2 were determined by real-time PCR and western blot. The apoptosis and migration of MG63 cells were detected in vitro by flow cytometry and the wound healing assay respectively. Results MiRanda and TargetScan showed that miR-499-5p was well complementary with AKT2 gene. Compared with the control group, the expressions of AKT2 mRNA (45.06±8.12)% and protein(0.32±0.05)decreased when miR-499-5p over-expression(P<0.05). Compared with the control group, the apoptosis(18.97±2.41)% of MG63 cells was promoted and the migration(63.54±5.43)% was suppressed after transfection of miR-499-5p(P<0.05). Conclusion MiR-499-5p may down- regulate AKT2 expression in osteosarcoma MG63 cells, which could play a role in promoting cell apoptosis and inhibiting cell migration.

miRNA；AKT2；osteosarcoma MG63 cells

宋文金(1973-)，男，辽宁盘锦人，副主任医师。E-mail：lywangxueqin@163.com

论著10.11724/jdmu.2016.04.03

R738. 1

A

1671-7295(2016)04-0326-04

2016-04-11；

2016-07-06)