结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成及抗结核药物靶标

马郁芳

(大连医科大学 基础医学院 生化教研室，辽宁 大连 116044)



结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成及抗结核药物靶标

马郁芳

(大连医科大学 基础医学院 生化教研室，辽宁 大连 116044)

结核分枝杆菌是结核病的致病菌。UDP-N-乙酰葡糖胺是结核分枝杆菌细胞壁的重要糖基供体及前体分子，其生物合成由三种酶催化的四步反应完成。磷酸葡糖胺变位酶GlmM催化第二步反应，GlmU双功能酶催化最后两步反应。glmM及glmU基因敲除分别导致细菌细胞壁受损、细菌裂解及死亡，因此，GlmM和GlmU可作为研发抗结核新药的作用靶标。建立GlmM及GlmU酶活性检测方法、揭示其酶学特性、解析GlmU的晶体结构，便于人们筛选及定向设计酶抑制剂，以期发现新一代抗结核药物。

结核病；结核分枝杆菌；UDP-N-乙酰葡糖胺；GlmM；GlmU

[引用本文]马郁芳.结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成及抗结核药物靶标[J].大连医科大学学报，2016,38(4)：313-319.

结核病是由于结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis) 感染而引起的慢性传染病。在19世纪，欧洲有1/4的人死于结核病，因此，结核病被称为“白色瘟疫”。在20世纪四五十年代，随着链霉素、利福平、异烟肼等抗生素及抗菌药物的出现，结核病一度得到了治愈。

然而，近年来，由于结核分枝杆菌多重耐药 (multi-drug resistant, MDR) 菌株及广泛耐药 (extensive drug resistant, XDR) 菌株的出现和传播以及HIV的协同作用，现有的抗结核药物不能有效地治愈结核病，使结核病疫情回升，成为危害人类健康的严重传染病[1-2]。据世界卫生组织 (WHO) 报道[3]，2014年全球新增960万例结核病患者，并有150万人死于结核病，其中40万人是HIV阳性。目前，中国仍是全球22个结核病高负担国家之一，结核病年发病人数约为130万，位居全球第二位 (《全国结核病防治规划 (2011-2015 年)》国办发[2011]53 号文件)。因此，迫切需要研发新的抗结核药物来改善结核病流行现状。

目前，针对明确的药物作用靶标来筛选及定向设计化合物是研发新药的常用策略之一，通常以病原细菌的酶或蛋白质作为靶标筛选或定向设计抑制剂，以期发现新的抗菌药物[4-5]。细胞壁是维持结核分枝杆菌生长繁殖和感染宿主所必需的物质基础，一旦细胞壁的生物合成受到抑制，必将导致细菌死亡。所以，参与结核分枝杆菌细胞壁代谢的酶可作为药物作用的靶标。

1　结核分枝杆菌细胞壁核心结构

与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌相比，结核分枝杆菌细胞壁的结构独特、复杂，其核心结构 (core structure) 由分枝菌酸 (mycolic acid)、聚阿拉伯半乳糖 (arabinogalactan) 和肽聚糖 (peptidoglycan) 三种大分子构成[5-6]。分枝菌酸是含 70～90 个碳原子的脂类分子，形成包裹在细菌表面、致密的低通透性外层。中层的聚阿拉伯半乳糖由聚阿拉伯糖 (arabinan) 和聚半乳糖 (galactan) 构成，分枝菌酸与聚阿拉伯糖连接，而聚半乳糖通过二 (双) 糖衔接分子 (disaccharide linker)：L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺 (L-Rhamnose-N-GlcNAc) 共价连接到肽聚糖的N-乙酰胞壁酸分子上 (图1)，肽聚糖与细胞膜相连。在细胞壁核心结构中，还有与其以非共价键结合的脂阿拉伯甘露聚糖 (lipoarabinomannan)、肽糖脂 (peptidoglycolipid) 及细胞壁蛋白[6-7]。

图1　结核分枝杆菌细胞壁核心结构及抗结核药物作用靶标Fig 1 Schematic diagram of the core structure of M. tuberculosis cell wall and action sites of anti-tuberculosis drugs

揭示结核分枝杆菌细胞壁代谢规律和分子机制，便于人们确定抗结核药物的特异性靶标，为研发高效且低毒的抗结核药物提供理论依据。现有的一线抗结核药物包括异烟肼 (Isoniazid)、利福平 (Rifampicin)、吡嗪酰胺 (Pyrazinamide) 和乙胺丁醇 (Ethambutol)[8]，其中异烟肼和乙胺丁醇就作用于结核分枝杆菌细胞壁。异烟肼的作用靶标是InhA，通过抑制InhA的功能而阻断分枝菌酸的生物合成。而乙胺丁醇的作用靶标是EmbB，EmbB失活导致聚阿拉伯糖的生物合成受阻[7]。二线抗结核药物乙硫异烟胺 (Ethionamide)[7]和环丝氨酸 (Cycloserine)[7, 9]分别抑制分枝菌酸和肽聚糖的生物合成 (图1)。

在研发抗结核新药过程中，目前已发现作用于细胞壁的酶抑制剂及候选药物[7,10]。阿拉伯糖 (Arabinose) 是构成细胞壁聚阿拉伯糖的基本单位，而DP-阿拉伯糖是聚阿拉伯糖形成时的活化底物 (糖基供体)。在DP-阿拉伯糖形成过程中，结核分枝杆菌DprE1 (Rv3790) 和DprE2 (Rv3791) 蛋白构成的异源二聚体催化DP-核糖的差向异构化而生成 DP-阿拉伯糖[11]。苯并噻嗪酮类 (Benzothiazinones, BTZ) 化合物能够抑制DprE1 蛋白的功能而阻断DP-阿拉伯糖的形成，使聚阿拉伯糖的生物合成受阻 (图1)，从而抑制结核分枝杆菌的生长[12-13]。小鼠感染模型的实验结果表明，BTZ化合物BTZ043可以阻止结核分枝杆菌的感染且没有明显副作用[12]。因此，BTZ043有可能成为治疗结核病的临床药物[14]。二硝基苯甲酰胺 (Dinitrobenzamide) 衍生物DNB1/DNB2也作用于DprE1蛋白，抑制聚阿拉伯糖的合成[15]。

2　UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途径

连接分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖的二糖衔接分子 (L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺) 是维持细胞壁核心结构完整性的重要分子，dTDP-鼠李糖 (dTDP-Rhamnose) 和UDP-N-乙酰葡糖胺 (UDP-GlcNAc) 是形成二糖衔接分子的糖基供体[6,16]。UDP-N-乙酰葡糖胺又是合成肽聚糖的前体分子，MurA和MurB催化UDP-N-乙酰葡糖胺转变为UDP-N-乙酰胞壁酸 (UDP-MurNAc)，UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰胞壁酸作为糖基供体用于肽聚糖聚糖链的形成[17]。

UDP-N-乙酰葡糖胺 (UDP-GlcNAc) 的生物合成由三种酶催化的四步反应完成。glmS基因编码的谷氨酰胺果糖-6-磷酸转移酶 (GlmS) 催化底物果糖-6-磷酸和谷氨酰胺生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸，glmM基因编码的磷酸葡糖胺变位酶 (GlmM) 催化葡糖胺-6-磷酸转变为葡糖胺-1-磷酸。glmU基因编码的 GlmU是双功能酶，其葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶 (简称乙酰基转移酶) 活性催化底物葡糖胺-1-磷酸 (Glucosamine-1-phosphate, GlcN-1-P) 与乙酰 CoA (AcCoA) 发生反应，使GlcN-1-P的氨基乙酰化，生成 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸 (N-acetylglucosamine-1-phosphate, GlcNAc-1-P)；GlmU的乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶 (简称尿苷转移酶) 活性催化 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸与UTP反应，生成UDP-N-乙酰葡糖胺 (UDP-GlcNAc)[18-19](图2)。由于UDP-N-乙酰葡糖胺是细胞壁代谢中重要的糖基供体和前体分子，UDP-N-乙酰葡糖胺通路是潜在的抗结核药物作用靶点[20]。

真核生物也需要UDP-N-乙酰葡糖胺作为糖基供体参与蛋白质的N-连接糖基化修饰或蛋白聚糖的形成，但其合成途径与结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺合成途径有所不同，真核细胞中不存在由GlmM催化的第二步反应以及由GlmU乙酰基转移酶活性催化的第三步反应。虽然将N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转变为UDP-N-乙酰葡糖胺的第四反应在结核分枝杆菌和真核细胞中相同，但人体细胞中催化此反应的AGX 酶与GlmU尿苷转移酶之间没有同源氨基酸序列，提示二者的催化机制可能不同。如果以结核分枝杆菌GlmM和GlmU乙酰基转移酶作为靶酶，可能会发现高效、毒副作用小的新型抗结核药物。

图2　结核分枝杆菌UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成途径Fig 2 Biosynthetic pathway of UND-GlcNAc in M. tuberculosis

3　GlmM

结核分枝杆菌H37Rv 菌株的glmM 基因含有1347 bp，编码的磷酸葡糖胺变位酶GlmM含有448个氨基酸，分子量为45.87 kDa。Sassetti等[21]利用转座子突变技术发现编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的 glmM (1347 bp) 是结核分枝杆菌生长的必需基因。Li等[22]以耻垢分枝杆菌 (Mycobacteriumsmegmatis) 为结核分枝杆菌的实验模式菌，构建了耻垢分枝杆菌glmM基因敲除菌株，发现glmM基因为耻垢分枝杆菌生长的必需基因，glmM基因缺失引起细菌裂解，甚至死亡。Kang等[23]构建了耻垢分枝杆菌glmM基因敲减菌株，发现glmM基因表达下调不仅使细菌生长速率减慢、细胞形态异常以及生物被膜形成能力明显减弱，还能使细菌对作用于细胞壁的抗结核药物异烟肼及乙胺丁醇的敏感性明显增加。因此，获得靶向GlmM酶的化合物有可能发现新的抗结核药物，或为联合用药治疗结核病提供新思路。

建立快速、灵敏的GlmM酶活性检测方法是建立GlmM酶抑制剂高通量筛选平台的前提条件。由于GlmM酶的催化反应特点，可通过偶联GlmU乙酰基转移酶活性，用化学显色法间接检测GlmM酶活性。Li等[22]利用E.coliBL21(DE3) 表达出可溶的结核分枝杆菌GlmM，用Ni-NTA基质纯化出GlmM酶，并建立了间接检测其酶活性的方法。GlmM酶催化底物GlcN-6-P生成GlcN-1-P，在GlmU乙酰基转移酶的催化下，GlcN-1-P与AcCoA生成GlcNAc-1-P和CoA。CoA含有巯基，可将化合物DTNB还原为黄色的TNB，在405 nm处进行检测 (图3)。GlmM与GlmU乙酰基转移酶偶联的酶促反应在96孔板中进行，适用于高通量筛选酶抑制剂。一旦筛选出酶抑制剂，需要用直接检测GlmM酶活性的方法进行确认，或用GlmU乙酰基转移酶活性检测方法进行确认。

图3　偶联GlmU乙酰基转移酶的GlmM酶活性化学显色检测法Fig 3 Colorimetric detection of GlmM enzymatic activity by coupling GlmU acetyltransferase (AT) activity

Jia等[24]用高效阴离子交换色谱-电化学检测器 (HPAEC-PAD) 建立了直接检测GlmM酶活性的方法。用CarboPac PA-100柱 (4 mm×25 mm) 分离GlmM 酶的底物GlcN-6-P 与产物GlcN-1-P，然后用电化学检测器检测。通过计算底物峰面积的减少或产物峰面积的增加来确定底物消耗量或产物增加量，从而计算GlmM酶活性。该方法可同时检测底物的减少与产物的生成，与上述GlmM酶活性间接检测方法相比，灵敏度高，在研究GlmM酶催化机制时可更准确地计算酶活性。虽然GlmM酶活性的直接检测法不适用于GlmM酶抑制剂的高通量筛选，但可用于GlmM酶抑制剂的确认及其抑制作用机制的研究。

中国科学院微生物研究所的李学兵等曾根据GlmM 酶催化的反应设计并化学合成了其底物葡糖胺-6-磷酸的类似物葡糖胺甲苷-6-磷酸，期待葡糖胺甲苷-6-磷酸能竞争性抑制 GlmM酶活性，但实验结果显示葡糖胺甲苷-6-磷酸不能抑制GlmM酶活性 (待发表)。

磷酸化修饰是最普遍的蛋白质翻译后修饰形式，已发现真核生物的蛋白质磷酸化修饰与细胞增殖、分化、新陈代谢、凋亡等几乎所有的细胞生命活动有关[25]，而对原核生物的蛋白质磷酸化修饰及其作用了解甚少。Prisic等[26]通过对结核分枝杆菌中磷酸化蛋白质组的分析，鉴定出301种磷酸化蛋白，其中包括GlmM酶。这些磷酸化蛋白在细菌细胞壁肽聚糖合成、与宿主免疫系统相互作用等方面发挥着重要作用[27-28]。因此，研究磷酸化对GlmM酶活性的调节机制，不仅可以丰富原核生物蛋白质磷酸化修饰的内容，也为基于GlmM靶酶的抗结核新药的研发提供新思路。

4　GlmU

结核分枝杆菌H37Rv 菌株的glmU 基因含有1488 bp，编码的GlmU双功能酶含有495个氨基酸，分子量为51.58 kDa。Sassetti等[21]的转座子突变实验结果显示，glmU也是结核分枝杆菌生长所必需的基因。Zhang等[19]的研究结果显示glmU基因缺陷导致分枝杆菌细胞壁严重受损，最终引起细菌裂解和死亡。Soni等[29]发现在常氧和缺氧的条件下，GlmU缺失能改变结核分枝杆菌细胞形态，细胞壁厚度降低。当结核分枝杆菌在THP-1细胞及豚鼠中存活时，GlmU也是必不可少的。结核分枝杆菌感染豚鼠4周后，GlmU的耗尽导致豚鼠肺部荷菌量明显减少。Zhou等[30]建立了结核分枝杆菌GlmU乙酰基转移酶和尿苷转移酶的活性测定方法 (图4) ，并对两种酶活性进行了表征。

图4　GlmU乙酰基转移酶 (A) 和尿苷转移酶 (B) 活性的化学显色检测法Fig 4 Colorimetric detection of GlmU acetyltransferase (AT) (A) and uridyltransferase (UT) (B) activities

本课题组利用GlmU蛋白截短策略，确定GlmU蛋白N端的1～227 氨基酸序列为尿苷转移酶活性结构域，C端的228～495氨基酸序列 (含268个氨基酸) 为乙酰基转移酶活性结构域 (图5)。GlmU乙酰基转移酶结构域的确定为研究其氨基酸活性位点缩小了范围。Soni等[29]证实GlmU乙酰基转移酶和尿苷转移酶活性均为结核分枝杆菌生存所必需。

图5　GlmU乙酰基转移酶和尿苷转移酶活性结构域Fig 5 The domains of GlmU acetyltransferase and uridyltransferase

Zhou等[31]用单点定点突变方法获得4种glmU突变基因并构建出相应的表达载体，用BL21(DE3) 分别表达出4种GlmU蛋白突变体，即Lys362 (K362)，His374 (H374)，Tyr398 (Y398) 及 Trp460 (W460) 分别被Ala替代。与野生型GlmU蛋白相比，4种GlmU蛋白突变体的乙酰基转移酶活性均丧失90%以上，说明Lys362，His374，Tyr398 和 Trp460是维持GlmU乙酰基转移酶活性的重要氨基酸。

基于GlmU乙酰基转移酶和尿苷转移酶活性的化学显色检测法能够用于其抑制剂的高通量筛选，Rani等[32]已高通量筛选出GlmU抑制剂。针对GlmU乙酰基转移酶的底物葡糖胺-1-磷酸进行不同的化学修饰，发现2-氨基-3-氟-2, 3-二去氧葡萄糖-1-磷酸能够抑制 GlmU乙酰基转移酶活性，其作用方式为反竞争性抑制，初步证明葡糖胺-1-磷酸可作为发现GlmU 乙酰基转移酶抑制剂的平台分子[33]。

Zhang等[34]首先解析了结核分枝杆菌GlmU酶的晶体结构，GlmU的天然结构是同源三聚体，每一单体由尿苷转移酶结构域、乙酰基转移酶结构域和铰链螺旋构成 (图6)。Jagtap等[35]分别获得结核分枝杆菌GlmU酶与其底物和产物的共结晶GlmU (AcCoA) 和GlmU (CoA:GlcN-1-P)，利用X射线衍射技术得到晶体结构，揭示了GlmU乙酰基转移酶的催化机制，确定His374，Ala391，Asn397和Ser416是催化氨基酸残基，例如被His374和Asn397激活的氨基对底物乙酰辅酶A 的羰基碳进行亲核攻击。另外，Protein Data Bank (PDB) 数据库 (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 中还存在着不同结核分枝杆菌GlmU酶复合物的晶体结构。

图6　结核分枝杆菌 GlmU的结构Fig 6 The structure of M. tuberculosis GlmUA: GlmU的天然三聚体结构；B: 每一亚基由尿苷转移酶结构域、乙酰基转移酶结构域和铰链螺旋构成[34]

结核分枝杆菌GlmU晶体结构使人们能够利用分子对接 (Molecular docking) 方法[36]来分析GlmU酶与其抑制剂的相互作用方式；同时，GlmU酶晶体结构也便于人们对化合物数据库 (如PubChem) 进行计算机虚拟筛选 (Virtual screening)[37-38]以及定向设计[39]GlmU酶抑制剂，但虚拟筛选出的GlmU酶抑制剂和定向设计的GlmU酶抑制剂都需要进行实验验证。目前，Mehra等[40]用虚拟筛选方法获得GlmU乙酰基转移酶的抑制先导化合物。

5　结　语

UDP-N-乙酰葡糖胺是二糖衔接分子和肽聚糖糖链形成时的糖基供体和前体分子，抑制UDP-N-乙酰葡糖胺的形成，将影响结核分枝杆菌细胞壁的完整结构，导致细菌裂解、死亡。参与UDP-N-乙酰葡糖胺形成的GlmM和GlmU酶是分枝杆菌生存所必需的酶，以GlmM和GlmU为靶酶研发的抗结核新药将具有高药效性。结核分枝杆菌GlmM和GlmU乙酰基转移酶所催化的反应在哺乳类细胞中不存在，以其为靶酶所研发的抗结核新药可能对人体无害，能够克服抗菌药物也杀害正常细胞的缺点。

总之，全球日益严峻的结核病疫情使抗结核新药的研发受到了前所未有的重视，期望在现有研究工作的基础上，早日研发出新一代抗结核药物，进而实现有效治疗结核病的长远目标。

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Biosynthesis of UDP-GlcNAc in Mycobacterium tuberculosis and drug targets of anti-tuberculosis

MA Yu-fang

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofBasicMedicine,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Mycobacteriumtuberculosisis a pathogen causing tuberculosis. UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) is an important sugar donor and precursor in the cell wall ofM.tuberculosis. The biosynthetic pathway of UDP-GlcNAc includes four steps which are catalyzed by three enzymes. Phosphoglucosamine mutase (GlmM) catalyzes the second reaction and a bifunctional enzyme GlmU with glucosamine-1-phosphate acetyltransferase and N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase activities catalyzes the last two sequential steps in the formation of UDP-GlcNAc. The gene knockout of GlmM and GlmU results in cell wall destruction, bacterial lysis and death. Therefore, GlmM and GlmU are drug targets for developing anti-tuberculosis. Development of GlmM and GlmU enzyme assays and characterization of GlmM and GlmU enzymes as well as determination of crystal structure of GlmU will be helpful for screening and designing inhibitors of GlmM and GlmU to develop new drugs of anti-tuberculosis.

tuberculosis;Mycobacteriumtuberculosis; UDP-GlcNAc; GlmM; GlmU

973计划项目 (2012CB518803；2006CB504405)；国家自然科学基金项目 (81573469；30970067；30670454)

马郁芳(1962-)，女，辽宁大连人，教授，博士生导师。研究方向：微生物生物化学与分子生物学。E-mail: yufangma427@126.com

专家述评10.11724/jdmu.2016.04.01

R378

A

1671-7295(2016)04-0313-07

2016-06-01；

2016-07-02)