鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响研究

舒建中

(重庆市中医院，重庆 400021)



鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响研究

舒建中

(重庆市中医院，重庆 400021)

目的探讨鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响。方法将80只健康SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组以及黄芪注射液腹腔注射组，每组20只。除假手术组外，其余组均建立大脑中动脉永久梗死性模型；黄芪注射液鞘内注射组和黄芪注射液腹腔注射组分别给予黄芪注射液鞘内注射和腹腔注射，假手术组和缺血再灌注组鞘内注射生理盐水，采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达情况。结果假手术组术后1 h、2 h、8 h、24 h神经功能评分均为0分，而缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组随着术后时间的延长神经功能评分呈现降低的趋势，其中黄芪注射液鞘内注射组术后2 h、8 h、24 h神经功能评分均明显低于其他2组(P均<0.05)，黄芪注射液腹腔注射组术后8 h、24 h神经功能评分均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05)；假手术组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；缺血再灌注组术后3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数明显少于假手术组(P均<0.05)，黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数均显著多于缺血再灌注组(P均<0.05)，且黄芪注射液鞘内注射组明显多于黄芪注射液腹腔注射组(P均<0.05)。结论鞘内注射黄芪注射液能够有效减轻局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损程度，促进神经干细胞增殖。

鞘内注射；局灶性脑缺血；神经上皮干细胞蛋白

局灶性脑缺血又被称为缺血性脑卒中，主要是由于大脑内血液供应系统障碍引起脑组织缺氧缺血，最终造成相应区域脑梗死性坏死或神经元丧失而产生神经功能缺损症状。相关研究表明，我国是脑血管疾病高发国家，每年新发病例大约在200万，约有150万死亡，且存活者中约有70%患者存在神经功能障碍，给患者家庭和社会带来沉重的负担[1]。黄芪注射液是当前治疗缺血性脑血管疾病常用药物，其不仅能够改善病变组织及周围微环境，且可促进病变区域神经干细胞(NSC)的增殖和分化[2]。但中药注射液不易透过血脑屏障，故传统给药方式静脉、口服等削弱了药物的作用，而鞘内注射给药是一种简便有效的途径[3]。基于此，本研究通过实验探讨了不同途径给予黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达的影响，从而为中药制剂治疗脑梗死提供更有效的途径。

1　实验资料

1.1实验动物健康SD大鼠，月龄4～7个月，体质量(220±20)g，贵阳中医学院实验动物中心提供；饲养条件：50%相对湿度，22 ℃，自由饮食进水。

1.2药物黄芪注射液，神威药业有限公司生产，国药准字Z13020999，10 mL/支，含生药1 g。

1.3主要试剂与仪器Nestin免疫组化试剂盒，上海研吉生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯；Olympus IX71-22FL/PH 型荧光显微镜，日本；CoolSNAP-Pro cf Color Digital Kit显微成像系统，美国Media Cybernetics公司；ELT-13V-85 型超低温冰箱，美国HARRIS公司。

1.4实验方法

1.4.1分组将80只SD清洁大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组以及黄芪注射液腹腔注射组，每组20只。

1.4.2模型的制备

1.4.2.1线栓的制备将直径0.205 mm、长约4 cm的尼龙鱼线头端用酒精灯外焰烤钝，使其呈圆形膨大，直径0.28～0.44 mm。在距头端18 mm和21 mm上分别作上标记，浸入0.1%多聚L-赖氨酸溶液中过夜，取出放在60 ℃烤箱条件下1 h备用。

1.4.2.2大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)局灶缺血模型的制备除假手术组外，其余组均采用线栓法造成MCAO模型。参考ZeaLongas方法，略有改良：大鼠称质量，用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于手术台上，术区备皮，0.5%碘伏消毒，铺洞巾。取颈部正中纵切口，长约2 cm，依次暴露颌下腺、胸锁乳突肌、肩胛舌骨肌，分别用自制小拉钩拉向两旁固定，选取左侧大脑中动脉(MCA)做缺血侧，右侧为正常对照。于10倍手术显微镜下分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及其分支甲状腺上动脉和枕动脉、颈内动脉(ICA)及其分支翼腭动脉，用双极电凝器电凝并切断颈外动脉分支甲状腺上动脉和枕动脉，用翼腭钩钩取翼腭动脉，3.0手术线靠近根部结扎，暂留取线头以供提拉用，于ECA处分出甲状腺上动脉和枕动脉后的远端，结扎ECA，在结扎线远端电凝并切断，随后ICA和CCA分别置显微动脉夹，在ECA断端距动脉分叉3 mm处的动脉壁上用显微手术剪刀侧切小口，插入备用线栓，头端至CCA分叉处调整线栓走向，使其与ICA近一直线，移去ICA夹，线栓至ICA颅内段时迅速推进，线栓插入深度约18 mm，扎紧ICA，以防线栓移位及出血，血管外留线约10 mm，移去CCA动脉夹，观察无渗血后缝合皮肤。术中保持室内温度25 ℃，保持肛温37 ℃。术后30 min用乙醚再次麻醉大鼠后将尼龙线轻轻拔退约1 cm，此时记为再灌注0 h。假手术组仅切口皮肤，分离左侧CCA，插线深度为9 mm。将麻醉苏醒后的大鼠放回鼠笼，单笼饲养，自由饮食，剔除发生呼吸困难、出血量过多的大鼠。

1.4.2.3大鼠鞘内置管模型的制备①导管的制备：选取聚乙烯硬膜外导管，根据鞘内置管要求将其剪成10 cm长，然后血管钳夹住导管的两端，放置在80～100 ℃的热水中加热，待导管变软后分别从导管两侧用力向外拉伸，使其外径减少0.2 mm为最佳，接着采用微量注射器将导管容量定到20 μL，将导管多余部分减掉，备用。②麻醉诱导及切口定位：大鼠腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg进行麻醉诱导，麻醉后剃除大鼠颈腰部毛发，并将其俯卧位固定在手术台上，以大鼠两侧髂棘连线为L6棘突，然后再向上数3个间隙(L3—4)定为手术切口。③手术方法：于L3—4间隙处做长0.8～1.0 cm的皮肤纵向切口,依次切开皮肤、 皮下筋膜,显露肌层,在棘突旁用尖刀背钝性分离附着于L3—4棘突一侧的肌肉,暴露白色椎板,在L3—4两关节突结合处内侧,用镊子夹住导管尖端轻柔地将导管向上置入1.5～2.0 cm；置管成功后，大鼠会产生甩尾反射，且导管内可见脑脊液流出。④导管固定：导管放置成功后，固定于皮下筋膜处，并将导管另一端经过皮下隧道从颈部引出，外露约1.5 cm，最后进行缝合并固定，并采用消毒针头将导管外口堵住，以免脑脊液外溢。

1.4.3造模前后干预方法分别于术前30 min及术后6 h，假手术组、缺血再灌注组鞘内注射生理盐水，每次30 μL/kg；黄芪注射液鞘内注射组鞘内注射30 μL/kg黄芪注射液，黄芪注射液腹腔注射组按5 mL/kg腹腔注射给药(用药剂量参照成人肌注与鞘内给药比例)。

1.5观察指标

1.5.1神经功能评分在术后1，2，4，8，24 h观察肢体瘫痪、转圈等神经系统症状，并进行提尾悬空实验。参考MACO局灶缺血模型神经功能评分(ZeaLonga5分评分)标准[4]，分别在术后4，8，24 h进行评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.5.2Nestin表达情况采用免疫组化法检测术后1 d、3 d、7 d Nestin表达情况。术后1 d、3 d每组每次随机选7只，术后7 d每组6只。在戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉后开胸，经升主动脉插管,然后采用150 mL生理盐水冲去血液，继而灌注含40 mg/L 多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4)350 mL，灌注后立即取延髓放置于相同的新鲜灌注液中固定，至组织块沉底。洗去表面的固定液,取材，采用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，片厚约8 μm。然后将切片放置在60 ℃烤箱中1 h，取出进行梯度脱水、脱蜡，并采用PBS进行冲洗，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，切片于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,25 min;冷却后,滴加抗原修复液30 min,双蒸水洗; 滴加正常山羊血清60 min,不洗,甩去多余液体;滴加小鼠抗大鼠Nestin一抗(1∶ 2 000,Sigma),室温下(25 ℃)孵育1 h,再4 ℃下过夜,PBS洗;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(博士德二抗试剂盒)室温下60 min,PBS洗;滴加试剂SABC,室温60 min,PBS洗15 min×4次;DAB显色(博士德),室温下20 min,双蒸水多次洗涤;脱水、透明,中性树胶封片。上述没有提及洗涤时间均为10 min×3次。阴性对照实验中采用正常山羊血清和磷酸盐缓冲液PBS代替Nestin 一抗，其余步骤同上。最后取免疫组化反应阳性切片的相邻切片HE染色进行病理观察。切片在光镜的统一放大倍数(10×40)下,由摄像机摄取细胞图像输入MIAS-300型黑白图像分析系统,设置相等的检测窗口面积为平均阳性细胞面积。随机选相互不重叠的10个视野计算Nestin 阳性细胞数。

1.6统计学方法所得数据均输入计算机中，并采用SPSS 16.0软件进行统计处理，计量资料数据采用 表示，两两间比较采用Student-Newman-Keuls检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1神经功能评分假手术组术后1 h、2 h、8 h、24 h神经功能评分均为0分；而缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 h神经功能缺损评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；随着术后时间的延长3组神经功能评分呈现降低的趋势，而黄芪注射液鞘内注射组术后2 h、8 h、24 h神经功能评分均明显低于其他2组(P均<0.05)，黄芪注射液腹腔注射组术后8 h、24 h神经功能评分均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05)。见表1。

表1　4组大鼠脑缺血后各时刻神经功能评分比较±s，分)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与缺血再灌注组比较，P<0.05；③与黄芪注射液腹腔注射组比较，P<0.05。

2.2脑组织中Nestin表达情况假手术组术后1 d、3 d、7 d脑组织中Nestin阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；缺血再灌注组呈现逐渐下降的趋势，而黄芪注射液鞘内注射组和黄芪注射液腹腔注射组呈现逐渐升高的趋势；与假手术组比较，缺血再灌注组术后3 d、7 d脑组织中Nestin阳性细胞数显著减少(P均<0.05)，黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d均显著增多(P均<0.05)；与缺血再灌注组比较，黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d 脑组织中Nestin阳性细胞数均显著增多(P均<0.05)，且黄芪注射液鞘内注射组均明显高于黄芪注射液腹腔注射组(P均<0.05)。见表2。

表2　4组大鼠脑组织中Nestin表达情况，个)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与缺血再灌注组比较，P<0.05；③与黄芪注射液腹腔注射组比较，P<0.05。

3　讨　　论

脑缺血后病理生理变化极为复杂，急性期主要表现为神经细胞凋亡，慢性期主要表现为神经功能重建和脑组织修复。目前关于脑缺血后神经细胞凋亡的发病机制尚不明确。但相关研究发现，脑缺血引起的中枢神经系统兴奋性氨基酸尤其是谷氨酸的释放以及重摄取受阻碍，将会导致突触后膜氨基酸受体激活，造成神经元损伤，最终造成大量神经细胞坏死、凋亡[5-6]。传统观点认为，哺乳动物中枢神经元是终极细胞，若神经元损伤后将会丧失再生能力。近年来随着对干细胞的研究深入，不仅颠覆了上述观点，同时也为脑缺血后恢复期以及后遗症期神经细胞的修复和再生带来了新的契机。神经干细胞是一种具有分化为星形胶质细胞、神经元细胞及少突角质细胞的能力，且可自我更新并能够提供大脑脑组织细胞的细胞。Nestin是一种中间丝蛋白Ⅵ，也是神经干细胞的标记蛋白，其主要分布在细胞质中，表达于中枢神经系统干细胞中[7]。Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失[8]。Nestin基因可能主要在神经干细胞阶段表达。当脑组织发生缺血等病理改变时，将会导致大量的神经干细胞定向迁移、分化或增殖等，从而修复受损组织结构。国外学者研究认为，虽然在脑组织缺血的状况下，机体自身可以激活脑组织中神经干细胞的增殖，但是在没有任何干预措施下，脑缺血诱导产生神经干细胞数量极为有限，且多数增殖的神经干细胞很容易通过凋亡机制迅速死亡，因此认为脑缺血后自我修复和适应性反应尚不能改善脑缺血的神经功能[9]。基于此，有学者提出，促进脑组织中神经干细胞的增殖以及存活，可能是促进脑组织神经功能的恢复，实现治疗脑缺血的一个潜在作用的新靶点[10]。

局灶性脑缺血在中医学中属于“中风”的范畴，其病因主要与痰、虚、风、火、瘀等有关，其发病机制主要为气虚血瘀，因此治疗应以益气活血为主。黄芪是传统的益气药物，其主要成分为黄芪皂苷、黄芪酮以及黄芪多糖等，具有健脾益肺、利尿脱毒、补气通阳之功效。现代药理研究表明，黄芪不仅具有抗血小板聚集、增加毛细血管抵抗力、调节血压、正性肌力作用，同时还具有改善血-脑屏障通透性，增加大脑中营养因子的分泌和局部血流量，提高ATP酶的活性，降低缺血脑组织兴奋性氨基酸含量和自由基含量，抗脑损伤以及促进神经功能恢复的效应[11]。有研究发现，黄芪注射液在没有血清和其他细胞因子的条件下，可诱导室管膜前下区(SVZa)神经干细胞的定向分化，同时流式细胞仪检测发现，在SVZa分化的细胞中有60%的神经元为酪氨酸羟化酶阳性神经元，故认为黄芪注射液对神经元具有一定的保护作用[12]。韦云飞等[13]研究发现，黄芪注射液可有效促进缺血后脑组织中Nestin表达，同时可促进神经干细胞分化为神经胶质细胞和神经元，在神经元发育及修复中具有重要作用。

鞘内注射即蛛网膜下腔注射，使药物直接作用于脑脊液中，从而弥补血脑屏障造成的脑组织中药物有效浓度不足[14]。有研究表明，鞘内注射同位素标记白蛋白，可在5 h左右到达脑底表面蛛网膜下腔；同时此种给药方式还可促使药物随着脑脊液循环自然到达蛛网膜下腔各脑池中，从而弥散于整个脑室系统[15]。

本研究结果显示，缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组随着术后时间的延长神经功能评分呈现降低的趋势；其中黄芪注射液鞘内注射组术后2 h、8 h、24 h神经功能评分明显低于其他2组，黄芪注射液腹腔注射组术后8 h、24 h神经功能评分均明显低于缺血再灌注组；假手术组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数比较差异均无统计学意义；缺血再灌注组术后3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数明显少于假手术组，黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数均显著多于缺血再灌注组，且黄芪注射液鞘内注射组明显多于黄芪注射液腹腔注射组。表明鞘内注射黄芪注射液可明显减轻局灶性脑缺血后大鼠神经功能的损伤程度，促进脑缺血后神经干细胞的增殖，有助于脑缺血后神经组织的重建。但是其具体机制还需要进一步深入研究。

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Study on the effects of intrathecal injection of astragalus injection on neural stem cells after focal cerebral ischemia

SHU Jianzhong

(Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing 400021,China)

Objective It is to explore the effects of intrathecal injection of astragalus injection on neural stem cells after focal cerebral ischemia.Methods 80 healthy SD rats were randomly divided into sham operation group (A group),ischemia reperfusion group (B group),intrathecal injection of astragalus injection group (C group) and intraperitoneal injection of astragalus injection group (D group) 4 groups,with 20 rats in every group,who were established permanent middle cerebral artery occlusion model.The mice in the C and D groups were respectively given intrathecal injection and intraperitoneal injection of astragalus injection,which in the A and B groups were given intrathecal injection of normal saline,then the expressions of neuroepithelial stem cell protein(Nestin) of the mice in the 4 groups were observed by immunohistochemical method.Results The nerve function scores in the A group after 1 h,2 h,8 h,24 h of operation were 0,of which the B,C and D groups decreased with the extension of time,and the degrees of decline of scores in the C group after 2 h,8h and 24 h of operation were significantly higher than those of the other two groups (P<0.05),and the scores of the D group after 8 h,24 h of operation were significantly lower than those of the B group (P<0.05).There was no difference in the positive number of Nestin positive cells in brain tissues in the A group after 1 d,3 d and 7 d of operation (P>0.05).Compared with the ositive number of Nestin positive cells in brain tissues in the A group,those in the B group after 3 d and 7 d of operation were significantly decreased,of which the C and D groups after 1 d,3 d and 7 d were significantly increased(P<0.05).Compared with the ositive number of Nestin positive cells in brain tissues in the B group,those in the C and D groups after 1 d,3 d and 7 d were signifciantly increased(P<0.05),of which the C groups after 1 d,3 d and 7 d were obviously higher than those of the D group(P<0.05).Conclusion Intrathecal injection of astragalus injection can effectively reduce the degrees of neurological deficit and promote the expression of Nestin in brain tissues,which plays a significant role on neural stem cell proliferation in rats after focal cerebral ischemia.

intrathecal injection; focal cerebral ischemia; neuroepithelial stem cell protein

舒建中，男，副主任医师，研究方向为中西医结合诊治脑血管病。

贵州省中医药管理局课题(QZYY2011-29)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.16.002

R-332

A

1008-8849(2016)16-1714-04

2016-01-30