僵蚕天南星方对大鼠急性缺血性脑水肿MMP-2表达的影响

黄晓松，罗银利，于春艳，谭李红，易艳辉

(1.湖南省脑科医院，湖南 长沙 410007；2.江苏省邳州市中医院，江苏 邳州 221300)



论著

僵蚕天南星方对大鼠急性缺血性脑水肿MMP-2表达的影响

黄晓松1，罗银利1，于春艳2，谭李红1，易艳辉1

(1.湖南省脑科医院，湖南 长沙 410007；2.江苏省邳州市中医院，江苏 邳州 221300)

目的探讨僵蚕天南星方对大鼠急性缺血性脑水肿基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响及其作用机制。方法将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、僵蚕天南星方组，除假手术组外，其他2组采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型，采用免疫组织化学法、RT-PCR法观察各组大鼠缺血2 h再灌注24 h、48 h、72 h、96 h大脑皮质中MMP-2的表达情况。结果模型组及僵蚕天南星方组再灌注各时间点MMP-2阳性细胞数明显多于假手术组(P均<0.05)，僵蚕天南星方组再灌注各时间点MMP-2阳性细胞数明显少于模型组(P均<0.05)；模型组再灌注各时间点MMP-2mRNA表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)，僵蚕天南星方组再灌注各时间点MMP-2mRNA表达量明显低于模型组(P均<0.05)。结论僵蚕天南星方可能通过抑制MMP-2的表达而减轻脑水肿，改善大鼠缺血性脑损伤。

僵蚕天南星方；脑缺血再灌注；脑水肿；基质金属蛋白酶

脑血管疾病严重危害人类的健康，其具有高发病率、高致残率、高病死率、高复发率、高额负担等流行病学特点。脑水肿是缺血性脑血管病中基本病理变化之一，也是导致患者病情加重甚至引起死亡的主要原因。基质金属蛋白酶2(MMP-2)是MMPs家族中重要成员，脑缺血过程中表达增高的MMP-2可降解细胞外基质，导致脑微血管结构完整性和血脑屏障破坏，造成继发性脑水肿和脑损伤。本实验根据缺血性脑卒中的病机特点，研究僵蚕天南星方对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮质中MMP-2表达的影响，探讨该方防治脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1　实验资料

1.1实验材料SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g，购自湖南中医药大学动物实验中心，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。实验时大鼠体质量(286±3.79)g。MMP-2试剂盒购自武汉博士德生物公司，批号：BA0569；PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒(批号：K136907E)、浓缩型DAB试剂盒(批号：K132429A)购自中杉金桥生物公司，EDTA组织抗原修复液购自珠海市泉辉企业有限公司；Trizol购自Invitrogen，货号：15596-026；DEPC处理水购自上海基尔顿生，货号：BYL40387；SYBRGreen PCR试剂盒购自Thermo，货号：F-415XL；逆转录试剂盒购自Thermo，货号：#K1622。僵蚕天南星方由僵蚕9 g、制天南星5 g组成，饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院药房，熬制药液浓度为0.35 g/mL。

1.2实验方法将大鼠随机分为假手术组、模型组和僵蚕天南星方组，每组48只。模型组和僵蚕天南星方组均采用Zea longa线栓改良法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。造模方法：大鼠于术前禁食12 h，自由饮水；用10%水合氯醛腹腔注射麻醉[1](用量=体质量/100×0.35+0.1 mL)，大鼠仰卧位固定在手术台上，颈部常规备皮消毒，取颈正中稍偏右切口逐层切开，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，用眼科剪于颈总动脉结扎的远心端剪一小口导入栓线，将栓线(直径0.26 mm或者0.28 mm，长40 mm)从颈总动脉插入颈内动脉，插入(19±1.0)mm，用缝合线系住栓线，留置栓线于体外2 cm，确认无活动性出血后缝合皮肤，常规络合碘消毒，术后2 h后抽出线栓。假手术组除不插入线栓外，其他步骤均同线栓法。术后大鼠单笼饲养，自由饮水和进食。术后大鼠清醒后，僵蚕天南星方组给予僵蚕天南星方1 mL/d灌胃，假手术组、模型组均给予生理盐水1 mL/d灌胃。

1.3检测指标

1.3.1MMP-2阳性表达情况采用免疫组化法检测。每组分别于再灌注24 h、48 h、72 h、96 h各取6只大鼠麻醉后灌注取脑，在视交叉前后冠状切取2 mm厚的脑组织进行常规固定、脱水、透明、石蜡包埋、组织切片，片厚5 μm。切片做免疫组化，每只大鼠6张切片，每张切片取缺血灶周围5个互不重叠的高倍镜(×400)视野，计数每个高倍镜视野下的阳性染色细胞数，取其平均值。

1.3.2MMP-2 mRNA表达情况采用RT-PCR法检测。每组中分别于再灌注24 h、48 h、72 h、96 h各取6只大鼠麻醉后断头取脑，冰上操作，去额极和枕极各2 mm，剥取右侧大脑皮质组织，-80 ℃冰箱保存，PCR测定操作按试剂盒说明书：①用Trizol抽提标本脑组织和细胞中总RNA。②逆转录cDNA，将试剂盒从-80 ℃冰箱取出,复融，将5×逆转录buffer，dNTPs，MMLV，oligo(d T)10 000 r/min离心数秒，将经过稀释后的RNA样本进行RT，反应条件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，灭活MMLV。③Real-time PCR扩增，将制备好的cDNA进行PCR扩增，MMP-2引物：长度为165 bps，上游：5’-ACCAAGAACTTCCGACTATCC-3’，下游：5’-CTGAGCAATGCCATCAAAGAC-3’；Gapdh引物：长度为181 bps ，上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游：5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’；由基尔顿生物科技(上海)有限公司合成。MMP-2扩增条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环；溶解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析。

2　结　　果

2.13组不同时点MMP-2阳性表达情况模型组及僵蚕天南星方组梗死侧MMP-2表达主要位于血管内皮细胞及星形胶质细胞胞质、胞膜中，均在24 h明显增高，72 h达高峰，以后开始下降，96 h仍高于假手术组。模型组及僵蚕天南星方组再灌注24 h、48 h、72 h、96 h MMP-2阳性细胞数均明显多于假手术组(P均<0.05)，僵蚕天南星方组各时点MMP-2阳性细胞数明显少于模型组(P均<0.05)。见表1。

2.23组不同时点MMP-2mRNA表达情况模型组再灌注24 h、48 h、72 h、96 h MMP-2mRNA表达量均明显高于假手术组(P均<0.05)，僵蚕天南星方组各间点MMP-2mRNA表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表1　3组不同时点MMP-2阳性表达情况，个)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3　讨　　论

脑水肿是指因脑组织中积聚过多的水所导致的病理性脑组织肿胀，是广泛性脑损伤后的严重并发症，脑水肿的形成与兴奋性氨基酸的神经毒作用、细胞膜钠泵失调、自由基堆积、脑细胞膜磷脂代谢障碍及基质金属蛋白酶有关，主要有细胞毒性、血管源性、间质性3种病理类型，疾病早期以细胞毒性水肿为主，疾病后期亦包括血管源性水肿。有实验研究表明，脑缺血再灌注损伤引起脑水肿是导致神经损伤的病理机制之一[2]。

表2　3组不同时点MMP-2mRNA表达情况

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

MMP-2是MMPs家族的成员，可使血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)血管基膜和紧密连接破坏，导致BBB通透性增加，一方面有利于炎性细胞和炎性因子通过BBB，导致脑组织损伤；另一方面加重脑水肿[3]。有研究证实，MMP-2参与急性期脑水肿过程[4]。在脑缺血再灌注的早期，MMP-2被膜型基质金属蛋白酶(Membrane-type Matrix Metalloproteinase,MT-MMP)激活，破坏紧密连接蛋白[5]，从而使循环中的重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)等物质进入脑内。向大鼠脑内直接注射MMP-2，可以通过破坏脑毛细血管紧密连接和基底膜导致BBB的开放，引起血管源性脑水肿[6]。梅利等[7]研究显示，脑梗死的发生可能与MMP-2、IL-1β水平的增加有密切关系，二者协同作用加重了对血管壁的炎性损害，造成脑缺血再灌注损伤，并与患者神经功能缺损程度相关。

急性缺血性脑血管病中医称之为“中风病”，以突发昏扑、不省人事、半身不遂、语言謇涩或失语、口舌歪斜、偏身麻木等为主要临床表现，因其发病特点与风邪善行数变的特性有相似之处，故古代称其为“中风”。痰瘀是中风病的主要发病机制，始终存在于整个病程，在中风的发生、发展与转归中起重要作用。因此，在中风的治疗过程中，化痰祛瘀至关重要。僵蚕天南星方中僵蚕味辛行散，能祛风、化痰、通络，天南星味苦辛性温，走经络，善祛风痰，两药合用，共奏化痰通络之效。现代药理研究发现，僵蚕具有抑菌、抗惊厥、抗凝等作用[8]，天南星具有抗惊厥、镇痛、镇静、祛痰、抗氧化、杀灭钉螺、抗菌和抗炎等多种药理活性[9-12]。

本研究结果显示，模型组及僵蚕天南星方组梗死侧MMP-2表达主要位于血管内皮细胞及星形胶质细胞胞质、胞膜中，均在24 h明显增高，72 h达高峰，以后开始下降，96 h仍高于假手术组，和脑水肿的进程一致。采用免疫组化法及RT-PCR法检测MMP-2表达，结果显示僵蚕天南星方组再灌注各时间点MMP-2阳性细胞数明显少于模型组，MMP-2 mRNA表达量明显低于模型组。本课题组前期研究发现，僵蚕天南星方可减轻脑缺血再灌注损伤后脑水肿的神经功能损伤[13]，综合本研究结果，僵蚕天南星方减轻缺血性脑水肿的作用机制可能与降低MMP-2的表达有关。

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Effects of Silkworm Arisaema decoction on the expression of Matrix Metalloproteinase 2 in rats with acute ischemic brain edema

HUANG Xiaosong1,LUO Yinli1,YU Chunyan2,TAN Lihong1,YI Yanhui1

(1.The Brain Hospital of Hunan Province,Changsha 410007,Hunan,China;2.Xuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xuzhou 221300,Jiangsu,China)

Objective It is to observe Silkworm Arisaema Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in rats with acute ischemic brain edema and to explore its effect mechanism.Methods The male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: the sham-operation group,the model group,the Silkworm Arisaema Decoction treatment group.The model of right middle cerebral artery occlusion was established by thread ligation method.The Sprague-Dawley rats received occlusion of the right middle cerebral artery for 2 h,and then reperfusion was made for 24 h,48 h,72 h,96 h respectively.The expressions of MMP-2 were evaluated by immunohistochemistry and real-time PCR at different time points.Results The expression of MMP-2 at four different time points in the model group and the Silkworm Arisaema Decoction group were significantly higher than that of the sham group(P<0.01).Compared with the model group,the expression of MMP-2 in the Silkworm Arisaema Decoction group at each time point were significantly reduced (P<0.01).The expression of MMP-2 mRNA at four different time points in the model group was significantly higher than that of the sham group(P<0.01).The expression of MMP-2 mRNA at four different time points in the Silkworm Arisaema Decoction group was less than that of the model group(P<0.01).Conclusion Silkworm Arisaema Decoction can improve brain tissue damage and reduce brain edema in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,the mechanism might be associated with reducing the expression of MMP-2.

Silkworm Arisaema Decoction; cerebral ischemia reperfusion; brain edema; MMP-2

黄晓松，男，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事脑血管疾病的研究。

谭李红，E-mail：tanlihong118@163.com

湖南省中医药管理局重点资助项目(201329)；湖南省中医药管理局一般资助项目(2013126)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.16.001

R-335

A

1008-8849(2016)16-1711-03

2015-12-31