链霉素发酵培养基的混料设计与研究

金伟，郑长春，郭强，高春慧，祈维蓉，柏莉娟，周东东，郭雷，卢春玲，郭晓梅，王静，柏莉欣，王刚

·技术与方法·

链霉素发酵培养基的混料设计与研究

金伟，郑长春，郭强，高春慧，祈维蓉，柏莉娟，周东东，
郭雷，卢春玲，郭晓梅，王静，柏莉欣，王刚

链霉素发酵工业已经有了比较长的历史，发展至今研究投入较大，生产水平也逐年增长，它的菌体生长和产物形成过程牵涉到一系列的生物化学反应过程［1］，包含着复杂的质量和能量传递，所以对其发酵过程难以进行人为控制，使得在具体生产实践过程中主要以经验作为依据，而理论知识方面较为匮乏。由于后来耳毒性的发现，各个国家对链霉素的产量和使用量开始出现明显下降［2］，但是近年来由于化学农药污染较为严重，各个国家开始研究易分解、杀菌谱广和药效强的生物农药，正是由于链霉素的这些优点，它逐渐开始广泛地应用于农牧行业，并且取得了非常好的效果。链霉素的获得主要是通过对灰色链霉菌的发酵培养，灰色链霉菌从培养基获得足够的营养组分和能量来合成链霉素，所以适宜的培养基成分和比例对于链霉素生产水平的提高至关重要。混料设计是一种研究配料中各组分的最佳比例的科学试验设计方法，因子是配料中的组分或分量［3］，可以深入研究成分对响应目标值的影响，以及各个成分之间的交互作用。应用传统的设计方法，比如单因素试验、正交试验等，费时费力，而且效率不高，无法精确地求取最优值，但是应用科学先进的实验设计方法就非常方便和高效。近几年来风靡全球企业的六西格玛科学管理方法，其中很重要的一部分就是试验设计理论，尤其是在研发领域［4］的应用效果更是得到了高度的评价。六西格玛工具中有一专门设计模块，可以完成混料试验设计的整个过程，并对实验数据进行回归分析，依据分析结果建立变量曲线方程，最后利用响应优化器求得最优值，能在最短的时间内利用最科学的理论方法得到所需要的目标值［5］，此种试验设计可广泛应用于化工、食品、医药和材料等各个涉及配方配比的领域。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器XHPC-3.22 型灭菌柜为山东淄博Shinva 公司产品；722N 型可见分光光度计为上海精科公司产品；SPH-3112 型双层摇瓶机为上海世平实验设备公司产品；L-530 型高速离心机为湘仪公司产品；PB-10 型 pH 计为德国 Sartorius 公司产品；SBA-40E 型生物传感分析仪为山东省科学院生物研究所产品。

1.1.2菌株供试菌种灰色链霉菌来自山东鲁抗集团链霉素生产车间菌种保藏室。

1.1.3试剂链霉素标准品（纯度大于 98%）购于美国Sigma 公司；葡萄糖、硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、盐酸羟胺和硫酸铁铵均为国产分析纯试剂；低温黄豆饼粉为济宁双华工贸公司工业级产品；碳酸钙为上海美宇牌工业级产品。

1.2方法

1.2.1培养基的制备培养基组成为葡萄糖 30 g/L、低温黄豆饼粉 25 g/L、硫酸铵 4 g/L、碳酸钙 5 g/L、硫酸二氢钾 0.4 g/L、氯化钠 2 g/L。先用蒸馏水溶解无机盐类，然后边搅拌边加入黄豆饼粉、碳酸钙和葡萄糖，搅拌均匀，pH 自然，115 ℃ 灭菌 30 min。

1.2.2培养方法对甘油管保藏的菌株进行稀释，将稀释度为 10-4的菌液涂布平板，在 27 ℃，湿度 30% ～ 50% 条件下培养 7 d，获得单菌落。选取丰满、白色、梅花状、边缘齐整的中型单菌落孢子，在无菌条件下用接种针接种于摇瓶中，然后在 27 ℃ 的恒温摇瓶间内振荡培养 68 h，取样进行链霉素含量测定，摇床转速为 220 ～ 240 r/min，摇瓶间湿度 30% ～ 50%。

1.2.3链霉素的含量测定采用分光光度法，利用链霉素特有的麦芽酚反应［6］进行检测。首先将发酵液进行适当的稀释，取 15 ml 置于离心管中，加入草酸酸化，酸化至 pH = 3 左右，于水浴锅中 75 ℃ 保温 10 min，冷却至室温，于离心机中 5000 r/min 离心 20 min，准备两支干净的试管，分别吸取 5 ml 离心后的上清液置于试管中，向其中一支试管加入 1 滴 4% 盐酸羟胺作为空白对照，再向两支试管中分别加入 1 ml 氢氧化钠溶液（2 mol/L），振荡摇匀，于水浴锅中 85 ℃ 保温 15 min，冷却至室温，再加入 1% 硫酸铁铵 2 ml，振荡摇匀，静置 10 min，在分光光度计中设定520 nm 波长下测定吸光度。以链霉素标准品绘制标准曲线，计算发酵液链霉素的效价。

1.2.4试验设计方法以 Minitab 软件［7］实现单纯形格子设计是混料回归设计方案中最先出现的，也是最基本的设计方案，很多其他设计方案的构成要用到单纯形格子设计［8］。在（n - 1）维正规单纯形（有 n 个顶点）d 阶格子点集｛n，d｝中各格子点的正规单纯形坐标（重心坐标）的计算中，取 n 个互相正交的单位向量，a1=（1，0，...，0），a2=（0，1，...，0），...，an=（0，0，...，1），则这 n 个单位向量的顶点便围成一个（n - 1）维正规单纯形，此正规单纯形上任一点 A 都可以表示为 A = i1a1+ i2a2+... + inan=（i1，i2，...，in），其中 i1，i2，...，in≥ 0，i1+ i2+ ... + ip= 1，当 i1，i2，...，in都取分母是 d 的分数时，即

则表达式 A 所确定的总体就是（n - 1）维正规单纯形的 d 阶格子点集｛n，d｝，也就是说可以算出｛n，d｝中各点的单纯形坐标系的坐标［9］。

本实验设计借助 Minitab 15 六西格玛辅助软件工具进行混料单纯形格点设计，根据鲁抗链霉素生产车间现有培养基配方，碳源和氮源的配比总和范围为 1% ～ 10%，碳源为葡萄糖，氮源为黄豆饼粉和硫酸铵，在此配方基础上，通过混料设计进一步研究这 3 种变量的最优配比组合，以进一步提高链霉素的发酵效价，增加公司盈利，所以这 3 种因子的单独取值范围为 1% ～ 8%，得到的设计方案如图 1 所示，3 维度共 13 个实验点。

图1　单纯形设计图（按数量）

2　结果

2.1Plackett-Burman 设计法

2.1.1设计与分析利用 Minitab 软件，按照 Minitab →Stat → DOE → Factorial design → Plackett-Burman design的顺序，对黄豆饼粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钠、碳酸钙、起始 pH 七个因素进行考察，采用试验次数 n = 12 的设计［10］，每个因素取 -1 和 +1 两个水平，响应值为效价（Y）。实验设计及结果见表 1，各因素水平及主效应分析见表 2。

由表 2 分析结果可知，主效应的 F 值为 13.31，P 值为 0.012，说明主效应是显著的，分析效果较好，再看具体的因素，t 检验对实验结果产生正效应的因素为：黄豆饼粉、葡萄糖和起始 pH。产生负效应的因素为：硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙和氯化钠。在灰色链霉菌发酵产生链霉素的发酵过程中，黄豆饼粉、硫酸铵和葡萄糖三个因素对链霉素的效价影响较为显著，应取这三个因素作为下一步混料设计实验的研究对象。其他因素则根据各因素 t 检验效应的正负来取相应的高值或低值［11］，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值，此时效价的平均值为 2803 U/ml。

表1　Plackett-Burman 实验设计与结果

表2　Plackett-Burman 因素水平及主效应分析

2.1.2Pareto 图Minitab 在 Pareto 图中显示效应的绝对值，如图 2，Pareto 图使用相同的 α 作为正态图来确定效应的显著性大小，其中响应值为效价，α = 0.05。

由图 2 可以看出，黄豆饼粉、硫酸铵和葡萄糖的效应较为显著，其中黄豆饼粉的效应最大，硫酸铵其次，葡萄糖在三者中效应最小。

2.1.3残差分析由图 3 可以看出，效价残差的正态性检验概率图符合正态分布规律，直线的相关系数达到了95.88%，在残差与拟合值图中，残差无规则地在水平轴上下随机波动（围绕 0），没有出现绝对数超过 3 个标准差的异常点［12］，说明模型的适合性较好。

图2　标准化效应的 Pareto 图

2.2混料设计

2.2.1混料实验安排及结果13 次混料试验［13］中，三种原材料的配比见表 3，其他原材料按照 2.1 Plackett-Burman设计结果中的效应正负取相应的数值，考察三种原料按不同比例对效价和细菌浓度的影响。

由表 3 的结果可以看出，三种原料按不同的比例混合对效价和细菌浓度有着不同的影响。效价最大值出现在第4 次实验运行中，为 3329 U/ml；细菌浓度最大值出现在第2 次实验运行中，为 57%。

2.2.2不同原材料配比对效价的影响利用 Minitab 软件中的混料设计分析选项可对实验结果进行分析拟合，模型中的分量项为完全立方模式，舍弃掉不显著项（P ＞ 0.05）AD、ABD 和 BD（B - D）之后，得到关于效价和原料的模型如下：

模型的 F 值为 27.38，P 值为 0.011，说明模型能较好地反映实际，模型方程的相关系数 r2= 98.74%，说明方程拟合度较高，在实验范围内该模型方程能够较准确地解释响应值的变化情况，可用来进行响应值分析和下一步预测。

混料设计可以根据各组分的三元等值线图［14］直观地观察各组分间的变化对指标的影响，通过响应的等值线图，可以直观地看出原材料的不同配比对响应值的影响变化趋势，黄豆饼粉、硫酸铵和葡萄糖的比例变化对于效价的等值线图见图 4。

由图 4 可以看出，不同的配比对效价有着不同的影响，在硫酸铵取值较大时效价取较小值，随着硫酸铵比例的减少，效价值越来越大，最大的效价取值出现在两个区域，分别在黄豆饼粉和葡萄糖取较大值时。

图3　效价残差图

表3　混料设计实验安排及结果

图4　效价的混合等值线图

图5　细菌浓度的混合等值线图

2.2.3不同原材配比对细菌浓度的影响同样利用 Minitab中的分析混料设计功能，模型中的分量项为二次［15］，得到关于细菌浓度和原料的模型方程：

表4　目标响应设置

模型的 F 值为 11.03，P 值为 0.005，说明模型能较好地反映实际，模型方程的相关系数 r2= 95.3%，说明方程拟合度较高。

通过响应的等值线图，可以直观地看出原材料的不同配比对响应值的影响变化趋势，黄豆饼粉、硫酸铵和葡萄糖的比例变化对于细菌浓度的等值线图见图 5。

由图 5 可以看出，在黄豆饼粉取较大值时细菌浓度取较小值，硫酸铵取较大值时细菌浓度也取较大值，而细菌浓度为 40% 出现在三角等值图的中间区域。

2.2.4响应值的优化基于建立的拟合度较高的模型方程［16］，利用 Minitab 中的响应优化器功能，可以求得在所研究区域内获得目标响应值时的各组分具体取值，在响应优化器的参数设定各个指标的优化目标，具体目标设置如表 4。

通过响应优化器功能，得到最优解为黄豆饼粉 = 0.0262626，硫酸铵 = 0.0196400，葡萄糖 = 0.0540974。响应值效价= 3225.13，合意性 = 0.912626，细菌浓度 = 39.97，合意性 = 0.999078；复合合意性 = 0.954874。

2.3验证实验

为了检验模型对各个参数的优化效果，在所确定的最佳发酵培养基配比下进行了五个批次的实验，最佳培养基配方和实验结果见表 5 和表 6。

由表 5 和表 6 可以看出，在 Minitab 设计的最佳培养基配方的条件下，各个批次实验的效价（Y）与模型效价的相对误差均小于 3.0%，平均相对误差为 1.58%，说明模型预测与实际取值较为吻合。五个批次的平均效价为3335.30 U/ml，与 Plackett-Burman 设计中的平均效价为2803 U/ml 相比提高了 18.9%，而五个批次的菌浓分别为38%、40%、36%、41% 和 42%，均在 40% 左右，未出现明显偏差，实验稳定性较好，具有可重复性，说明混料设计优化出的最佳培养基配比对于效价的提高和目标细菌浓度值的获得有着较好的效果。

表5　最佳培养基配方

表6　最佳配方条件下实验结果

3　讨论

本研究首先利用 Plackett-Burman 设计筛选出影响效价的最主要因素（黄豆饼粉、硫酸铵和葡萄糖），然后进行混料试验设计与数据分析，利用 Minitab 软件的绘图功能直观地观察出响应值随变量的变化趋势，最后利用响应优化器功能确定模型方程的最值点，也就是所研究因子水平范围内的响应值的目标点。混料设计中的单纯形格子设计能够将实验点取在正规单纯形的格点上，这样就保证了选取的实验点能够均匀分布，且计算快捷准确，从而在各个行业被广泛采用［17］。利用 Minitab 软件进行实验设计，其本质上是一种合理安排实验和科学分析实验数据的数理统计过程，可以对实验点进行科学合理设计［18］，实验的规模较小，实验的成本低，实验的次数也较少，设计简单快捷，实验周期短，效率高，能够得到理想的实验结果和正确的结论。

链霉素虽然是一种老产品，但是由于其独特的优点，成为一种常见的抗生素类杀菌剂，可以防治细菌病害，目前在国内外仍有巨大的市场。但是目前链霉素发酵生产存在着诸多问题，关键之一就是要解决生产成本，合理安排培养基组成和配比，提高产量和产品质量，但是由于其发酵工艺复杂，很难完全靠单一方法解决，因此将化学方法、仪器分析、生物分析和计算机模拟相结合是未来发展趋势。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.016

272000 济宁，山东鲁抗医药集团研发中心

金伟，Email：jinwei0538@163.com

2016-03-09