采用流式细胞术分选EAE模型小鼠小胶质细胞

浦颖艳，孙定亚，黄爱军，曹莉

·论著·

采用流式细胞术分选EAE模型小鼠小胶质细胞

浦颖艳，孙定亚，黄爱军，曹莉

目的获取实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型小鼠小胶质细胞，并检测其特性。

方法取 8 周龄，雌性 C57BL/6 小鼠行 EAE 造模，待至发病高峰期（第 15 天）时以 PBS 灌注后取小鼠后脑和脊髓，切碎后加胰酶消化，消化完成后通过 100 μm 滤网滤过，而后采用 Percoll 密度梯度离心法分离获取单个核细胞，进一步利用 CD11b 与 CD45 抗体染色，通过流式细胞仪分选 CD11b+CD45high和 CD11b+CD45low细胞，即分别得到相对活化和静息的小胶质细胞，最后对流式分选获取的小胶质细胞行 qPCR 检测。

结果通过形态比较，获得了高纯度的小胶质细胞。FIZZ-1基因行qPCR 检测，结果显示在 EAE 急性期 M2 型小胶质细胞明显增多，符合文献报道。

结论该方法能从 EAE 小鼠体内分离获取高纯度的小胶质细胞，可用于相关目的基因后续检测。

小胶质细胞；流式细胞术；实验性自身免疫性脑脊髓炎

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术， 2016， 11（4）：295-299

小胶质细胞在中枢神经系统中约占 12%［1］，是中枢主要的固有免疫细胞。静息状态下的小胶质细胞主要发挥中枢神经系统的监视作用。中枢的病理损伤可以激活小胶质细胞，发生形态学和分子表达谱的变化，参与吞噬、抗原呈递、调节血脑屏障和调控炎症反应强度等多种作用。作为中枢神经系统主要的免疫活性细胞，小胶质细胞与神经免疫性和神经退行性疾病高度相关。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型是研究神经免疫性疾病——多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）的经典动物模型。已有文献报道，在 EAE 小鼠的中枢神经系统，小胶质细胞的功能状态与 EAE 病情进展密切相关［2-4］。对于小胶质细胞基因表达的分析有助于了解其生理病理情况下的功能状态。

目前国内对小胶质细胞的功能研究主要采用BV-2 等细胞系和体外原代培养的小胶质细胞，直接分离成年小鼠的小胶质细胞用于研究的报道较少。细胞系和体外培养的小胶质细胞与体内细胞存在一定差异，无法准确反映某一生理病理状态下小胶质细胞表型状况。目前在中枢神经系统中，CD11b+CD45+细胞群是较公认的小胶质细胞/巨噬细胞群（小胶质细胞是定植于中枢的巨噬细胞）［5］，且 CD11b+CD45high与 CD11b+CD45low分别代表活化与静息的小胶质细胞［6-7］。结合以上情况，本研究采用改良的消化分离方法结合流式分选，获取高纯度的 EAE 小鼠小胶质细胞，并能够较准确反映其在炎性疾病某一过程中的表型状况，为研究小胶质细胞在炎性疾病不同病程中的功能动态变化提供了良好手段。

1　材料与方法

1.1实验动物和实验材料

1.1.1实验动物C57BL/6 小鼠，8 周龄，雌性，18 ～ 20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于清洁级动物房。

1.1.2试剂MOG 蛋白购自吉尔生化公司；百日咳毒素（PTX）购自美国 Calbiochem 公司；结核菌素购自美国 Difco 公司；弗氏不完全佐剂、Trizol和胰蛋白酶均购自美国 Invitrogen 公司；DNA 酶购自美国 Worthington 公司；Percoll 购自美国 GE公司；FC block、抗小鼠 CD11b-FITC 抗体、抗小鼠 CD45-PE 抗体均购自美国 BD 公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；SYBGreen PCR Mix购自日本 Toyobo 公司。

1.1.3实验仪器流式细胞仪为美国 Beckman公司产品。

1.2方法

1.2.1EAE 模型构建将不完全弗氏佐剂与结核菌素（终浓度为 4 mg/ml）在研钵中充分研磨，得到完全弗氏佐剂，再与溶解在 PBS 中的MOG 蛋白（终浓度为 1 mg/ml）按 1∶1 比例在三通管中充分混匀。百日咳毒素在 PBS 中稀释为终浓度 1 μg/ml 备用。在 C57BL/6 雌性小鼠背部选取 3 个点，皮下注射结核菌素和 MOG 蛋白混合液，总量 150 μl/只。小鼠腹腔注射百日咳毒素200 μl/只，计为第 0 天。第 2 天再腹腔注射百日咳毒素 200 μl/只。以空 PBS（无 MOG）与完全弗氏佐剂混合后造模作为对照。

1.2.2取材并制备单细胞悬液成年小鼠中枢内小胶质细胞分离纯化过程见示意图 1。在 EAE 发病高峰期（第 15 天）取正常组及 EAE 组小鼠各5 只，分别用 CO2窒息处死，冰上预冷 PBS 灌注去除血细胞后取后脑及脊髓置于 5 ml PBS 中，用刀片小心切碎至 1 mm3左右。加入等体积 0.25%胰酶和 1 ml DNA 酶，37 ℃ 水浴消化 15 min（每隔 5 分钟摇晃一次）后取出用 1 ml 枪头吹散组织块，继续置于 37 ℃ 水浴消化 10 min 后取出，用200 μl 枪头吹散后过 100 μm 滤网，800 × g 离心10 min。

1.2.3Percoll 分离液配制首先配制 100% percoll（10 × PBS 1.4 ml + percoll 12.6 ml），然后用100% percoll 配制其余密度梯度的 percoll 分离液，具体如下：

图1　成年小鼠中枢内小胶质细胞分离纯化过程示意图Figure 1　The sketch for isolation of microglia from EAE mice

37% percoll：100% percoll 3.7 ml + DMEM-F12 6.3 ml；70% percoll：100% percoll 7 ml + 1 × PBS 3 ml；30% percoll：100% percoll 3 ml + 1 × PBS 7 ml。

1.2.4密度梯度离心分离单核细胞将离心后沉淀细胞用 37% percoll 分离液 10 ml 重悬置于50 ml 离心管中，在其上下分别用微量注射器缓慢加入 30% 及 70% percoll 分离液各 10 ml，900 × g离心 30 min 后可见分层，去除上层呈白色的髓鞘片段，小心吸出位于 37% 与 70% percoll 分离液之间的单核细胞层约 8 ml，加入等量的 PBS 混匀，900 × g 离心 7 min，收集细胞沉淀。

1.2.5流式分选细胞沉淀用 200 ～ 500 μl FACS缓冲液重悬后加入 FC block 冰上静置 30 min 进行抗原封闭，随后离心，以 50 μl FACS 缓冲液重悬，每 106细胞中加入抗 CD11b-FITC 及抗CD45-PE 流式抗体 1 μl，冰上避光孵育 30 min 后离心弃上清，再以 FACS 缓冲液 400 μl 重悬，然后分别用流式细胞仪分选小胶质细胞，并用summit 软件计算细胞中 CD11b+CD45low及CD11b+CD45high的小胶质细胞比例。

1.2.6基因表达水平检测将分选得到的细胞用Trizol 法提取 RNA，按照试剂盒说明逆转录合成cDNA。Real-time PCR 检测 FIZZ-1 基因表达水平。反应体系为10 μl，其中 2 × SYBGreen PCR Mix 5 μl，2 μmol/L 的正反引物（FIZZ-1 引物序列为上游：5′ ATGCCAACTTTGAATAGGATG 3′，下游：5′ CTTGACCTTATTCTCCACGAT 3′；GAPDH 引物序列为上游：5′ TCAACGACCCCTTCATTGAC C 3′，下游：5′ CTTCCCGTTGATGACAAGCTTC 3′）各 1 μl，以及 cDNA 和水共 3 μl。反应条件为95 ℃ 5 min 进行预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s 扩增 40 个循环后行溶解曲线验证产物特异性。目的基因 FIZZ-1 的表达通过 GAPDH 为内参对其进行标化，并按计算公式 2-Δ（Δcq）计算得到倍数变化关系。

2　结果

2.1流式分选得到小胶质细胞比例

经过胰酶消化和 percoll 密度梯度离心后得到的单核细胞利用抗体标记后行流式分选，得到CD11b+CD45+细胞，结果显示，EAE 小鼠中活化小胶质细胞（CD11b+CD45high）比例为 21%，明显高于对照组小鼠（11%）（图 2），符合预期结果。同时利用流式分析软件观察 FSC-SSC 参数比较CD11b+CD45high和 CD11b+CD45low小胶质细胞，发现活化的小胶质细胞（CD11b+CD45high）要比静息的小胶质细胞（CD11b+CD45low）FCS 参数值高（图 3），即细胞体积大，这也与细胞学实验结果相符。

2.2FIZZ-1 在小胶质细胞中的表达

分选得到的小胶质细胞进一步经过 RNA 抽提，逆转得到 cDNA 后进行 real-time PCR 检测。结果显示，与对照组相比 EAE 组小胶质细胞中M2 型小胶质细胞特异性标志物 FIZZ-1 水平显著升高（图 4）。这与文献［8］报道相一致。并且为检测活化小胶质细胞其他目的基因的表达提供了依据。

图2　流式细胞仪分离小胶质细胞（A：EAE 小鼠分选小胶质细胞流式图；B：对照组小鼠分选小胶质细胞流式图）Figure 2　Isolation of microglia by flow cytometry （A： Representative image of microglia isolated from EAE mice； B：Representative image of microglia isolated from control adult mice）

图3　CD11b+CD45high（虚线）与 CD11b+CD45low（实线）小胶质细胞 FSC 参数比较Figure 3　A comparison of forward scatter （FSC） between CD11b+CD45high（dotted line） and CD11b+CD45low（solid line）cells

3　讨论

小胶质细胞是中枢神经系统的重要组成部分，它既是病理损害的主要传感器，能够分泌神经营养因子等，具有神经保护作用，同时也是中枢神经系统的炎症调节细胞，在病理状态下，活化的小胶质细胞能够通过释放大量促炎因子、促凋亡因子、趋化因子（例如 IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等）和NO 等引起神经毒性，导致神经元功能异常和引起细胞死亡，因此被认为是一把双刃剑［9-10］。如何能够有效抑制小胶质细胞的炎性损伤作用，而保留其对中枢神经系统的神经保护作用是临床治疗中枢神经炎症疾病的关键，也是目前研究的热点。

目前对于小胶质细胞的研究主要是由新生鼠和胎鼠脑组织纯化培养的原代小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型。获取方法主要是以 McCarthy 和 de Vellis［11］创立的原代胶质细胞混合培养为基础，结合振荡法、温和消化法等综合改良而成。体外培养的小胶质细胞主要取材于新生鼠或胎鼠，因此不是完全成熟的小胶质细胞，其表型与成年小鼠的小胶质细胞存在差异；同时长期培养也可能造成其表型与体内小胶质细胞存在差异。因此，这些体外小胶质细胞模型也许并不适用于成年动物的神经炎性疾病研究领域。而从成年小鼠取材得到小胶质细胞存在一定的难度，因此如何高效地从成年小鼠体内获得高纯度的原代小胶质细胞是关键。

图4　FIZZ-1 在对照组及 EAE 组来源小胶质细胞中的表达Figure 4　Relative FIZZ-1 expression in microglia between EAE mice and control

本研究从成年小鼠中枢神经系统取材，首次采用胰酶代替传统木瓜蛋白酶［12］，省去了繁琐的酶激活等步骤，至少节约 60 min，大大缩短了细胞消化的时间，在较短时间内即可快速完成消化步骤，并且保证了细胞的活性；后续利用密度梯度离心的方法去除了在中枢神经系统中占比最高的髓鞘，成功分离出包含小胶质细胞的单核细胞层；最后通过抗体标记结合流式细胞分选技术分离得到成年小鼠小胶质细胞，并且能够区分活化和静息两种状态，以便用于后续分别对两种小胶质细胞进行基因表达情况的分析［13］。

EAE 主要特征是中枢神经系统出现单核细胞浸润及脱髓鞘现象，为自身免疫性疾病，其模型是研究 MS 的理想动物模型，对于临床神经炎性疾病发生机制的研究具有重要意义。本研究利用流式分选得到对照组及 EAE 发病组小胶质细胞，通过流式细胞分析软件比较发现 EAE 发病组小鼠活化小胶质细胞（CD11b+CD45high）显著高于对照组小鼠。目前认为小胶质细胞的表型变化与其多种生理学功能有关，因此对于小胶质细胞基因表达的研究有助于了解其生理病理学功能，进而能够为治疗神经炎性疾病找到新的靶点。文献报道 FIZZ-1 是M2 型活化小胶质细胞标记物［6］，而 M2 型小胶质细胞在 EAE 急性期比例明显升高［8］。本研究中分别提取两组小鼠 CD11b+CD45low小胶质细胞RNA 进行基因表达分析发现，EAE 组 FIZZ-1 表达显著升高，提示本研究分离得到的小胶质细胞能够准确反映小鼠体内小胶质细胞基因表型变化，可以用于检测其他目的基因的变化，并进一步为神经炎性疾病寻找新的发病机制和治疗靶点。

综上，本研究所采用小胶质细胞分离方法简便快捷，同时得到的细胞能够准确反映其在体情况，克服了目前小胶质细胞研究所采用模型的局限性，为临床神经炎性疾病的研究提供了一种可靠的细胞模型。

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【Abstract】

ObjectiveTo obtain microglia from EAE mice for qPCR analysis.

MethodsFirstly， after the induction of EAE model using C57BL/6 mice at the age of 8 week， EAE or control mice were perfused and the spinal cords and tritocerebrums were isolated. Then the mononuclear cells were collected by density gradient centrifugation after digestion. Secondly， microglia were separated by flow cytometry sorting after anti-CD11b and anti-CD45 staining. Finally，collected microglia were analyzed by qPCR.

ResultsHighly purified microglia were obtained observed by the cell morphology. The following qPCR analysis showed a high expression of FIZZ-1 which is a M2 marker in EAE mice， and this was consistent with previous report.

ConclusionHighly purified microglia could be obtained by our method from EAE mice and the cells were suitable for following gene expression analysis.

Author Affiliation： Institute of Neuroscience and Key Laboratory of Molecular Neurobiology of the Ministry of Education， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：295-299

Isolation of microglia from EAE mice by flow cytometry

PU Ying-yan， SUN Ding-ya， HUANG Ai-jun， CAO Li

Microglia；Flow cytometry；Experimental autoimmune encephalomyelitis

CAO Li， Email： caoli@smmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.002

国家自然科学基金面上项目（81371326）

200433 上海，第二军医大学神经生物学教研室教育部分子神经生物学重点实验室

曹莉，Email：caoli@smmu.edu.cn

2016-03-09