MALDI-TOF-MS鉴定3种水稻细菌的方法

王文彬，匡 华，徐丽广，马 伟，刘丽强，胥传来

（江南大学 食品学院，江苏无锡214122）

MALDI-TOF-MS鉴定3种水稻细菌的方法

王文彬，匡 华，徐丽广，马 伟，刘丽强，胥传来*

（江南大学 食品学院，江苏无锡214122）

用哥伦比亚培养基培养了水稻细菌性谷枯病菌（NCPPB 2391，NCPPB 3591）、水稻细菌性条斑病菌（NCPPB 1585）、水稻细菌性褐斑病菌（NCPPB 2844），菌落采用乙醇/甲酸处理法处理后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析其蛋白质指纹图谱。除水稻细菌性条斑病菌无匹配结果外，其它2种细菌均有正确的鉴定结果。用Bruker公司标准方法建立了水稻细菌性条斑病菌蛋白质指纹图谱库。采用水稻叶片作为空白样品添加了上述3种植物病菌，回收实验结果表明3种植物病菌均可以用本方法检测。该研究为应用MALDI-TOF-MS方法检测水稻细菌奠定了基础。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；水稻病菌；检测

水稻是全球仅次于小麦的第二大粮食作物，也是中国最重要的粮食作物之一，水稻产量直接关系着中国的粮食安全。真菌、病毒或细菌引起的水稻病害轻者引起水稻减产，严重时可导致大片稻田颗粒无收［1］。水稻细菌性褐斑病是由丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）引起的一种细菌性病害，病害在我国主要分布在东北水稻产区［2］。水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola）是引起水稻条斑病的水稻细菌，最先发现于广东后来蔓延到湖南、江西、浙江、江苏等南方稻区［3］。水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae）是一种可引起苗期水稻秧苗腐烂、穗期水稻谷粒枯死的水稻细菌，主要分布于日本、越南，2007年已列入我国进境植物检疫性有害生物名录［4］。

目前水稻细菌性褐斑病还没有国标检测方法，检测方法也未见报道。水稻细菌性条斑病菌和水稻细菌性谷枯病菌目前均有国标检测方法，主要根据病株形态学特征，并采用分离培养、PCR（polymerase chain reaction）方 法 和 ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）方法结合生理生化以及菌株致病性进行鉴定。廖晓兰等建立了快速检测水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR方法，该方法可以区分水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌［5］。冯雯杰，张华分别建立了可以区分水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌的水稻细菌性条斑病菌的常规PCR方法，成本相对较低，适合在种子检疫站进行推广［6-7］。罗金燕等分别用常规PCR和免疫PCR检测水稻细菌性谷枯病菌，发现两种方法均可以特异性检测水稻细菌性谷枯病菌，但免疫PCR可以检测103cfu/ mL的菌悬液，灵敏度比常规PCR高两个数量级［8］。莫瑾等设计了两对水稻细菌性谷枯病菌的特异性引物，建立了双重PCR检测方法，提高了PCR检测的特异性，准确性和检测灵敏度［9］。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS）技术是一种软电离新型生物质谱，开始被用来鉴定蛋白和多肽的相对分子质量以及鉴定未知蛋白，后来在检测疾病标志物、微生物分类、临床微生物诊断等方面都得到成功的应用［10-12］。目前MALDI-TOF-MS已被广泛报道用于检测鉴定病原微生物，具有快速、重复性好的特点。作者报道了一种用MALDI-TOF-MS检测水稻细菌性谷枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、水稻细菌性条斑病菌的方法，为应用MALDI-TOF-MS检测其它水稻病菌奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株标准菌株：水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 2391），水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 3591），水稻细菌性条斑病菌 （Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola，NCPPB 1585），丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844），均购于英国NCPPB中心。

1.1.2培养基哥伦比亚琼脂培养基，购于杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3试剂无水乙醇：色谱纯，购自百灵威科技有限公司；甲酸（formic acid，FA）、乙腈（acetonitrile，ACN）：均为色谱纯，购于Sigma公司；基质 α-氰-4-羟基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA），校 准 蛋 白 干 粉（proteincalibration standard）：购自德国布鲁克公司。水稻叶片、玉米叶片由湖南检验检疫局提供，白菜购于本地超市。

1.1.4实验仪器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（ultrafleXtreme MALDI-TOF），德国布鲁克公司。生物安全柜，Thermo scientific。

1.2方法

1.2.1植物病菌的培养条件-80℃冻存的菌液在哥伦比亚琼脂培养基平板上划线，28℃培养2～3 d，传代2～3次。

1.2.2样品处理与鉴定参考陈秀金的方法进行MALDI-TOF-MS检测。

1.2.3建立细菌MALDI-TOF指纹图谱数据库按照布鲁克公司标准方法建立。

1.2.4样品添加回收水稻叶片用适量灭菌的蒸馏水冲洗3次，再用体积分数70%乙醇浸泡3min，随后用适量灭菌的蒸馏水浸泡洗涤，重复3次。取适量叶片于一次性平皿中，用一次性接种针将植物病菌接种到平皿中的叶片上。样品处理按照GB/T 28078—2011—水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法中未显症的可疑组织的方法进行。划线后的平板按照1.2.1的方法培养，平板上可疑菌落采集后采用1.2.2的方法进行处理和鉴定。

2　结果与讨论

2.1植物病菌培养条件

哥伦比亚培养基营养丰富，目前用于培养植物病菌的报道比较少。本研究中的几种植物病菌均采用哥伦比亚培养基培养效果不错，2～3 d可以长出米粒大小的菌落。培养温度，水稻细菌性谷枯病菌最适生长温度是30～35℃。水稻细菌性条斑病菌最适生长温度是28～30℃。丁香假单胞菌丁香致病变种，又称水稻细菌性褐斑病，最适生长温度是25～30℃。因此，作者采用了28℃培养，在该温度下3种植物病菌均可较好的生长。

2.2植物病菌蛋白质指纹图谱的建立

用TFA法对培养的4株植物病菌进行样品处理并用MALDI-TOF-MS分析，其蛋白质指纹图谱如图1～3所示。检索Bio-Typer数据库后4株菌的鉴定结果如表1所示。检索Bio-Typer数据库后，水稻细菌性谷枯病菌NCPPB 2391、水稻细菌性谷枯病菌NCPPB 3591和水稻细菌性褐斑病菌NCPPB 2844均有正确的匹配结果。鉴定结果如表1所示。水稻细菌性条斑病菌NCPPB 1585在数据库中没有匹配结果，检索后发现数据库中没有该菌的质谱数据库。因此，按照布鲁克公司标准方法建立了水稻细菌性条斑病菌NCPPB 1585的数据库。

可信度得分在2.300到3.000之间的结果可鉴定到种；可信度得分在2.000到2.299之间的结果确定鉴定到属，很可能是鉴定到种；得分在1.700到1.999之间的结果很可能可鉴定到属。水稻细菌性谷枯病菌NCPPB 2391可信度得分低于水稻细菌性谷枯病菌NCPPB 3591但均有正确的匹配结果。Bio-Typer数据库中没有水稻细菌性条斑病菌，因此作者采用布鲁克公司的标准方法建立了水稻细菌性条斑病菌的数据。水稻细菌性褐斑病菌NCPPB 2844又称丁香假单胞菌丁香致病变种鉴定结果为丁香假单胞菌，虽然没有鉴定到丁香致病变种，但在种的水平上是正确的。

2.3样品添加回收

图1　水稻细菌性谷枯病菌NCPPB 2391（上），NCPPB 3591（下）的蛋白质指纹图谱Fig.1　Protein mass spectrometric profiles of Burkholderia glumae NCPPB 2391（up）and Burkholderia glumae NCPPB 3591（down）

为研究基质影响和探索基于蛋白质指纹图谱的水稻病菌检测方法，选择用水稻叶片进行了样品添加实验。表2是各样品的鉴定结果，由表可知4株植物病菌的添加样品均可用该方法正确鉴定。

图2　水稻细菌性条斑病菌NCPPB 1585的蛋白质指纹图谱Fig.2　Protein mass spectrometric profile of Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola NCPPB 1585

图3　丁香假单胞菌丁香致病变种NCPPB2844的蛋白质指纹图谱Fig.3　Protein mass spectrometric profile of Pseudomonas syringae pv.syringae NCPPB2844

表1　纯培养菌株的M ALDI-TOF-MS指纹图谱在Bio-Typer数据库中的匹配结果Table 1　Matching results of pure cultures by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

表2　添加样品中分离株的M ALDI-TOF-MS指纹图谱在Bio-Typer数据库中的匹配结果Table 2　M atching results of isolated colonies from spiked sam ples by MALDI-TOF-MS in Bio-Typer

3　结语

近年来MALDI-TOF-MS技术已经越来越多地用来检测病原微生物，然而主要集中在沙门氏菌、单增李斯特菌等常见的食源性致病菌或者临床上重要的致病菌，而应用于检测水稻细菌的报道还比较少见。目前检测水稻细菌性条斑病菌、水稻细菌性谷枯病菌主要采用PCR扩增细菌特异性片段进行检测，检测灵敏度高、特异性好，但也存在着对操作人员技术要求高的特点。MALDI-TOF-MS检测方法基于细菌全细胞蛋白质的指纹图谱，具有操作简单、检测速度快、检测结果稳定的优点，因此相信随着研究的深入，MALDI-TOF-MS将成为检测水稻实际样品中病原菌的有力工具。

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Identification of Three Rice Pathogens by MALDI-TOF-MS

WANGWenbin，KUANG Hua，XU Liguang，MAWei，LIU Liqiang，XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A fter Burkholderia glumae（NCPPB 2391，NCPPB 3591），Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola（NCPPB 1585）and Pseudomonas syringae pv.Syringae（NCPPB2844）were cultured by Columbia agarmedium and bacterial colonies were treated w ith an ethanol-form ic acid extraction procedure，the protein fingerprints were obtained and analyzed by MALDI-TOF-MS.Three plant pathogenswere accurately identified except that Pseudomonas syringae pv.Syringae did notexist in the Bio-Typer.W ith the standard method from Bruker，we established the protein fingerprint of Pseudomonassyringae pv.syringae in Bio-Typer.For the rice leaf spiked w ith these rice pathogens，they could be detected using thismethod.This study shed lighton the detection of rice pathogensby MALDI-TOF-MS.

MALDI-TOF-MS，rice pathogen，detection

S435.11

A

1673—1689（2016）04—0370—05

2014-07-02

国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAC01B07）。

王文彬（1990—），男，河南南阳人，食品科学博士研究生，主要从事食品安全检测研究。E-mail：wenbin66@yeah.net

胥传来（1965—），男，江苏盐城人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事食品安全检测研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn