基于细菌16SrRNA基因扩增临床不常见病原菌的价值

曹敬荣，高世超，陈典典，陈 静，2，闵 嵘，王培昌（首都医科大学宣武医院，北京 00053；2江西卫生职业学院，江西南昌 33020）

基于细菌16SrRNA基因扩增临床不常见病原菌的价值

曹敬荣1，高世超1，陈典典1，陈 静1，2，闵 嵘1，王培昌1
（1首都医科大学宣武医院，北京 100053；2江西卫生职业学院，江西南昌 330201）

目的 探讨16S rRNA基因扩增与测序在临床不常见病原菌鉴定中的价值，指导临床相关感染的诊治。方法 选择临床微生物实验室常规方法难以准确鉴定、无法鉴定或有特殊表型的细菌12株，采用聚合酶链反应（PCR）扩增其16S rRNA基因，测序后进行BLAST比对鉴定菌种，并分析相关感染的临床特点。结果 12株菌经PCR扩增均得到阳性条带（约1 500 bp），均鉴定到种（相似度≥99%），分别为产单核细胞李斯特菌、马耳他布鲁杆菌各2株，死亡梭杆菌、空间罗氏菌、鼻疽奴卡菌、解糖葡萄球菌、放射性根瘤菌、二路普雷沃菌、解甘露醇罗尔斯顿菌及阴道阿托波菌各1株。16S rRNA基因扩增灵敏度高，大肠埃希菌ATCC25922的最低检测限为1.5× 101CFU/mL。12例患者临床资料显示上述菌可引起临床多部位、多类型感染，选用针对性抗菌药物治疗后11例好转，1例死亡。结论 16S rRNA基因测序方法可快速、准确鉴定少见菌、厌氧菌及难培养细菌，为临床不同类型感染的病原学诊断和治疗提供实验室依据。

16S rRNA；病原菌；鉴定；感染；分子生物方法；聚合酶链反应

病原学检测对感染性疾病的诊疗十分重要，目前，大部分临床微生物实验室采用商品化的鉴定系统鉴定病原菌，但对于临床少见、疑难或表型相近的细菌，该方法会出现偏差，不能满足临床快速、准确鉴定病原菌的需求［1］。随着分子生物学方法成本逐渐降低、基因数据库不断更新，基于细菌16S rRNA基因的测序技术在微生物界已成为热点［2—5］，并逐渐成为细菌菌种鉴定和分类的金标准［6—8］。本研究选择实验室常规方法难以准确鉴定、无法鉴定或有特殊表型的细菌，应用聚合酶链反应（PCR）扩增其16S rRNA基因并测序，探讨该方法在临床不常见病原菌鉴定中的价值。

1　材料与方法

1.1研究资料 选择临床微生物实验室常规方法难以准确鉴定、无法鉴定或有特殊表型的细菌12株。阳性质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、粪肠球菌ATCC 29212和铜绿假单胞菌ATCC 27853，阴性对照为白假丝酵母菌ATCC10231和双蒸水。

1.2主要试剂与仪器 主要试剂为Pathogen Lysis Tubes（L）和QIAamp○RUCP Pathogen Mini Kit （QIAGEN，Germany）、Premix Taq和DL2000 DNA Marker（TaKaRa，Japan）、细菌和酵母菌DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。主要仪器为涡旋振荡器（Vortex-Genie 2，Scientific In-dustries，USA）、PCR仪（Veriti 9902，Applied Bio-systems，USA）、电泳仪（北京六一仪器厂，中国）、凝胶成像仪（U-Genius，Gene Company，UK）、离心机（（Eppendorf AG22331，Hamburg，Germany）、生物安全柜（Thermo scientific，China）、全自动微生物鉴定仪（Vitek2 Compact，bioMerieux，France）、全自动血培养仪（BD BACTEC9120，USA）。

1.3培养及鉴定 需氧菌、兼性厌氧菌采用血平板、中国蓝平板，置于5%～10%CO2环境中进行培养，厌氧菌采用厌氧平板培养；脑脊液、血、关节液等培养采用BD公司BACTECTM9240全自动血培养系统，仪器报阳性后根据检验目的及镜检结果转种血平板、中国蓝及巧克力琼脂平板，35℃培养24～48 h。细菌鉴定时根据可疑菌落的革兰染色结果选择合适的鉴定卡，利用VITEK2 Compact全自动细菌鉴定系统鉴定。

1.416S rRNA基因PCR扩增

1.4.1DNA提取 实验菌株和标准菌株DNA的提取按DNA提取试剂盒说明书进行，获得的DNA模板—20℃保存。

1.4.2PCR扩增 根据文献［3］合成细菌通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），目的片段约1 500 bp，引物合成和测序委托英潍捷基（上海）贸易有限公司。反应体系25μL：Premix EX Taq 12.5μL，Primer上下游各1μL（10μmol/L），DNA模板5μL，双蒸水补足至25μL。PCR扩增参数为94℃预变性3 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1.2 min（35个循环），最终72℃延伸7 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外凝胶成像系统分析仪中进行观察。

1.4.3序列分析 PCR产物测序序列提交至Genbank数据库，挑选最佳BLASTN序列比对结果确定细菌种属。基因序列的同源性比对与结果解释参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）MM18-A的判定规则［9］：相似度≥99%判断为同种，相似度在95%～99%判断为同属，相似度91%～95%则判断为同科。

1.4.4最低检出限检测 大肠埃希菌ATCC 25922培养后制备浓度为0.5麦氏单位的菌液，采用10倍连续稀释法，使菌悬液浓度为1.5×108～1.5×101CFU/mL，提取不同浓度菌液DNA并进行PCR扩增，测试PCR扩增阳性所需最低样本含菌量。

2　结果

2.116S rRNA通用引物PCR扩增结果 12株临床分离少见菌和4株标准菌株（ATCC 25922、ATCC 25923、ATCC 27853和ATCC 29212）经PCR扩增，均获得与目的片段大小一致的基因片段（1 500 bp左右），白假丝酵母菌和双蒸水PCR扩增结果均为阴性。见图1。

图1　16S rRNA通用引物PCR扩增电泳图Figure 1 PCR amplification results of 16S rRNA by universal primer

2.216S rRNA基因测序结果 4株标准菌株的序列结果在GenBank中比对完全符合（100%）；临床标本分离的病原菌均鉴定到种水平（相似度≥99%）。病原菌16S rRNA基因序列分析结果与临床感染特征见表1。

表1　12株临床不常见病原菌株的来源、鉴定与临床感染特征Table 1 Sources，identification，and clinical infectious characteristics of 12 isolates of clinical rare pathogens

2.3PCR检测大肠埃希菌最低检测限 大肠埃希菌ATCC 25922的最低检测限为1.5×101CFU/mL，双蒸水（阴性对照）基因扩增结果为阴性。见图2。

图2　不同浓度大肠埃希菌PCR扩增电泳图Figure 2 PCR amplification results of Escherichia coli with different concentrations

2.4临床感染特征分析 12株少见细菌可引起呼吸道、皮肤软组织、胸腔、子宫内、中枢神经系统、血流等临床多部位、多类型感染，具有相应的临床表现和体征，临床结合病原菌鉴定结果及药敏结果选择针对性的抗菌药物治疗后，11例好转，1例死亡。

3　讨论

微生物鉴定及药敏结果是指导临床抗感染治疗的重要依据，准确、快速的病原学鉴定是协助临床正确诊治患者的前提，目前临床常规鉴定方法是根据细菌的菌落形态、革兰染色等进行的表型鉴定（如VITEK2 Compact等商品化微生物鉴定系统），其受多种因素的影响，常出现不能准确鉴定细菌的情况，尤其对临床少见菌的鉴定率低［1］。16S rRNA存在于所有原核生物中，能鉴定包括罕见菌、苛养菌、厌氧菌等在内的所有细菌［2—6］。蔡莹等［4］通过对临床84株菌的16S rRNA基因测序发现，该方法可增加病原体检测的敏感性和特异性、扩大病原谱、缩短检测时间、减少抗菌药物对检测的抑制作用，相对于常规方法更准确。本组大肠埃希菌ATCC25922的最低检测限为1.5×101CFU/mL，可微量检测病原菌。

本组4株标准菌株16S rRNA基因PCR扩增产物测序，结果与GenBank中相应菌株比对，符合率100%，且对革兰阴性菌或革兰阳性菌均适用，说明16SrRNA序列分析可靠，可用于临床菌株的鉴定。12株实验菌株经16S rRNA序列分析与比对，均鉴定到种水平（相似度≥99%），说明16S rRNA基因测序方法相较于常规方法鉴定谱更广、更准确［1，3］。4号菌VITEK2 Compact鉴定率低（33%的麦氏放线菌、丙酸杆菌和小棒状杆菌），无法给出准确的鉴定结果，其原因是系统不包含空间罗氏菌数据、且该菌生长缓慢、表型特征易与奴卡菌属、放线菌属等混淆所致，但序列测定可准确鉴定；5号菌生长缓慢、菌落不溶于生理盐水，常规方法很难鉴定，而16S rRNA序列分析可为临床确诊提供帮助，准确鉴定为鼻疽奴卡菌（99.9%）；6号菌与其他凝固酶阴性葡萄球菌表型特征相似，我国分离率极低，对其研究相对较少［11］，常规鉴定虽给出结果但鉴定率低，需16S rRNA等分子学方法进行确认（鉴定率99%）。此外，本组研究还发现了本实验室首次鉴定的细菌，如鼻疽奴卡菌和放射性根瘤菌；近年来命名的具有明确临床意义的细菌，如空间罗氏菌；VITEK2 Compact鉴定率低或鉴定错误的细菌，如解糖葡萄球菌、马耳他布鲁杆菌［8］等；以及专性厌氧性细菌，如二路普雷沃菌和阴道阿托波菌［12］。

研究［3—5］发现，厌氧菌、条件致病菌、少见菌［13］等引起的感染有增加趋势，给临床诊断和抗感染治疗带来困难，而基于16S rRNA基因的PCR扩增与测序可提供快速、准确的病原学结果，帮助临床医生针对性选用抗菌药物。由于大多苛养菌、厌氧菌不常规进行药敏而经验用药，如无准确的病原菌鉴定将误导临床诊治，马耳他布鲁杆菌如使用广谱抗菌药物治疗则临床无效，改用胞内药物（利福平、多西环素）后患者很快好转。5号菌的准确鉴定使得临床确诊肺奴卡菌病，并使用敏感的磺胺类药物，结合颅脑手术治疗，患者病情得以控制并很快好转。甲硝唑可有效治疗厌氧菌感染，而二路普雷沃菌和阴道阿托波菌对甲硝唑天然耐药，此2例患者更换抗菌药物（美洛西林/舒巴坦和克林霉素）治疗后很快好转。解糖葡萄球菌感染患者死亡，查病例发现该患者有入住重症监护病房（ICU）、多器官功能衰竭、感染性休克、混合细菌血流感染（解糖葡萄球菌和肺炎克雷伯菌）、年龄大等危险因素，最终导致死亡。产单核细胞李斯特菌是致命的食源性病原体之一，其易引起免疫功能低下或有基础疾病、老年人等发生血流感染、中枢神经系统感染等，因此对其准确的病原诊断非常重要。

综上所述，分子诊断在各类细菌感染诊断中具有明显优势，随着测序技术的不断发展和基因数据库的不断完善，基于细菌16S rRNA的测序方法在临床病原菌鉴定中的应用将越来越广，但16S rRNA是所有细菌共有，通用引物PCR扩增时一定严格控制污染，避免扩增假阳性而误导临床。另外，对于混合感染患者直接进行16S rRNA扩增和测序会导致鉴定率低或双峰，从而影响鉴定，因此16S rRNA的测序方法在非纯菌落或混合感染标本的直接检测中受限；对于种属间相似性较高（≥99%）的近缘菌，如溶血葡萄球菌等凝固酶阴性葡萄球菌间的鉴定分辨率低，且由于基因突变或基因转移等因素会影响16S rRNA鉴定率［14］，必要时需联合gap基因测序提高鉴定准确率［11］。因此，16S rRNA的测序方法应与表型方法，以及相关试验方法相结合，进行综合分析，以获得科学、准确的病原学结果，为临床诊断和改善感染患者预后提供帮助。

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（本文编辑：豆清娅）

Value of 16SrRNA gene amplification for identification of clinical rare pathogens

CAO Jing-rong1，GAO Shi-chao1，CHEN Dian-dian1，CHEN Jing1，2，MIN Rong1，WANG Pei-chang1（1 Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing100053，China；2 Jian-gxi Health Vocational College，Nanchang330201，China）

Objective To evaluate the value of amplification and sequencing of 16S rRNA gene in the identification of clinical rare pathogenic bacteria，and guide the diagnosis and treatment for related clinical infection.Methods 12 bacterial isolates that were difficult，or unable to be identified with conventional laboratory methods，or with special phenotypes were collected.The 16S rRNA gene was amplified by polymerase chain reaction（PCR），then sequenced for identifying bacterial species through BLAST comparison，clinical characteristics of related infection were ana-lyzed.Results 12 clinical isolates were all positive for PCR amplification（about 1 500 bp），species were all identi-fied（similarity≥99%），the identified strains were Listeria monocytogenes（n=2），Brucella melitensis（n=2），Fu-sobacterium mortiferum（n=1），Rothia aeria（n=1），Nocardia farcinica（n=1），Staphylococcus saccharolyticus （n=1），Rhizobium radiobacter（n=1），Prevotella bivia（n=1），Ralstonia mannitolilytica（n=1），and Atopobium vaginae（n=1）.The sensitivity of 16S rRNA gene amplification was high，and the minimum detection limit of Escherichia coli ATCC25922 was 1.5×101CFU/mL.Clinical data of 12 patients revealed that these strains can cause multi-sites and multi-types of infection，after patients received targeted antimicrobial therapy，11 improved，and 1 died.Conclusion Sequencing for 16S rRNA gene can rapidly and accurately identify rare，anaerobic，and difficult cultured bacteria，provide laboratory evidence for etiological diagnosis and treatment of different types of infection.

16S rRNA；pathogen；identification；infection；molecular biological method；polymerase chain reaction ［Chin J Infect Control，2016，15（4）：222—226］

R181.3+2

A

1671—9638（2016）04—0222—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.002

2015—08—22

首都临床特色应用研究重点专项课题（Z141107002514012）

曹敬荣（1979—），女（汉族），河北省邢台市人，主治医师，主要从事临床微生物检验、细菌耐药性及分子流行病学研究。

王培昌 E-mail：pcw1905@126.com