汕头地区4例散发创伤弧菌感染的实验室诊断

陈乐川，朱红军，周泽妍，柯永坚，陈钏文（汕头市中心医院，广东汕头5503；汕头潮南民生医院，广东汕头 5544）

汕头地区4例散发创伤弧菌感染的实验室诊断

陈乐川1，朱红军1，周泽妍2，柯永坚1，陈钏文1
（1汕头市中心医院，广东汕头515031；2汕头潮南民生医院，广东汕头 515144）

目的 了解汕头市某院创伤弧菌（VV）感染患者的病原微生物学特征及药物敏感性。方法 回顾性分析汕头市某院2013年6月—2014年6月收治的4例VV感染患者，采集患者血标本进行培养，采集患者疱液或棉拭子采集伤口分泌物接种于血平板、麦康凯平板及TCBS平板，对分离的菌株进行鉴定和药敏试验。结果 4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例；分别因进食腌蟹、蒸扇贝或外伤后接触海产品，而引起原发性败血症及下肢感染。患者A、B疱液，患者C伤口分泌物，患者D血培养均分离出氧化酶阳性、TCBS平板上生长呈绿色的革兰阴性菌，均鉴定为VV。VV对头孢唑林耐药或中介，对头孢替坦均为中介，1株VV对头孢吡肟耐药。结论 4例VV感染患者病死率高（3/4），疱液或伤口分泌物培养阳性率较血培养高；及时就诊、尽早开始抗菌药物治疗及积极清创有助于治疗该病。

创伤弧菌；药敏试验；抗药性，微生物；耐药性；食源性感染；伤口感染

［Chin J Infect Control，2016，15（4）：272—276］

创伤弧菌（Vibrio vulnificus，VV）为嗜温、嗜碱、低度嗜盐、嗜铁的革兰阴性（G—）菌，广泛存在于近海环境及多种海产品中，可引起人原发性败血症（病死率超过50%）和严重伤口感染（病死率约25%）［1］。感染者多为免疫功能低下或原有基础疾病者，通过进食未经煮熟的甲壳类海产品（尤其是生牡蛎），以及开放性伤口、破损皮肤暴露于带菌海水而感染。自1976年首次被美国疾病控制与预防中心（CDC）鉴定并命名以来，世界多地及国内沿海地区如浙江、台湾等地均有散在病例报道，潮汕地区罕见。本院于2013年6月—2014年6月共诊治VV感染患者4例，现将其临床特点及微生物实验室鉴定过程予以报告。

1　对象与方法

1.1研究对象 2013年6月—2014年6月诊治的4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例。4例患者起病均表现为发热、畏寒，继发下肢肿胀、疼痛，并出现散在水泡及瘀斑似烫伤样皮肤改变。病情进展迅速，3例双下肢感染者（患者A、B、D）出现感染性休克，2～11 d因多器官功能衰竭而死亡；1例（患者C）左下肢受累，经清创换药1月余并行创面清创植皮术后治愈。见表1。

表1　VV感染患者临床基本资料Table 1 Basic clinical characteristics of patients infected with V.vulnificus

1.2仪器与试剂 法国生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自动鉴定及药敏分析仪、血培养仪BACT/ALERT3D。血琼脂平板、麦康凯平板购自江门凯林贸易有限公司；TCBS平板由本实验室新鲜配制（TCBS琼脂购自北京陆桥技术股份有限责任公司），微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司，血培养瓶为法国生物梅里埃公司产品。

1.3 方法

1.3.1标本采集 标本均由临床医生采集，用无菌注射器采集A、B、D患者水/血疱穿刺液密封送检，用无菌棉签采集C患者下肢感染伤口的脓性分泌物，置无菌管保湿送检；同时，用需氧、厌氧瓶采集患者血标本进行培养。

1.3.2标本染色镜检及细菌分离 采用无菌注射器采集疱液标本转至无菌管中，2 500 r/min离心15 min，以及采用棉拭子采集感染伤口脓性分泌物直接接种于血平板、麦康凯平板、TCBS平板，置37℃CO2培养箱中培养24 h，观察结果，同时涂片行革兰染色。血培养瓶置血培养仪培养，阳性者行涂片革兰染色并转种于上述培养基。

1.3.3菌株鉴定及药敏试验 于平板上挑取菌落制成0.5麦氏单位浊度悬液，采用法国生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自动鉴定及药敏分析仪，按仪器操作说明进行，结果判断采用美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年标准。

2　结果

2.1染色及培养结果 直接染色镜检：疱液及伤口分泌物标本均检出少量G—杆菌，部分呈逗点状（白细胞++～+++，上皮细胞未见）。见图1。疱液、伤口分泌物标本37℃，CO2培养箱中培养24 h后，血平板上长出灰黄色、扁平、湿润、不透明菌落；麦康凯平板上无细菌生长或生长不良；TCBS平板上长出绿色湿润菌落。见图2。挑取菌落涂片染色镜检，为G—杆菌，氧化酶阳性。与血培养阳性标本转种培养基上的菌落生长情况基本相同。

2.2细菌学鉴定结果 所分离菌株经VITEK2Compact全自动鉴定及药敏分析仪鉴定为创伤弧菌。见表2。

2.3药敏试验结果 VV对头孢唑林耐药或中介，对头孢替坦均为中介，1株VV对头孢吡肟耐药，而对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢他啶、头孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、呋喃妥因、复方磺胺甲口恶唑等均敏感。见表3。

图1　疱液及伤口分泌物细菌革兰染色镜下形态（×1 000）Figure 1 Microscopic morphology of gram staining bacteria from blister fluid and wound secretion（×1 000）

图2　患者疱液标本在各营养培养平板上菌落生长情况Figure 2 Colonial growth of bacteria isolated from blister fluid on all kinds of culture media

表2　不同患者标本培养鉴定结果Table 2 Identification results of bacteria from different patients'specimens

3　讨论

VV或称海洋弧菌，隶属弧菌属第五群，G—菌、兼性厌氧、单极端单鞭毛，无芽孢、无异染颗粒、有荚膜，按生化反应特征可分为生物1、2和3型，引起人类感染的主要为生物1型。自然环境中该菌只能在盐度为0.7%～1.6%、温度＞20℃的水中生长［2］；抵抗力不强，冷冻或煮沸可被杀灭。通常环境分离株常无致病性，临床分离株有致病性。感染病例多分布于热带和亚热带沿海地区，3～11月好发，夏季（海面水温23～29℃）是发病高峰期［3］。其致病机制尚不明确，目前认为荚膜多糖（CPS）、运动鞭毛、Rtx毒素、铁获取能力等是必须的致病因子，脂多糖（LPS）、IV型菌毛、溶细胞素、金属蛋白酶等亦可能发挥重要作用［1］。

本组4例VV感染患者，其中食源性感染2例（1例治愈），伤口感染2例。发病时间均为夏季，均表现为急起发热伴畏寒，继发下肢特征性大疱性皮损，并肝、肾、心、呼吸、循环功能不全，结合患者均有长期吸烟史、长期饮酒史（除患者B外），存在基础疾病，并有海产品或海水接触史等可作初步诊断，患者血、疱液、伤口分泌物等培养分离出VV而确诊。抗菌药物治疗前及时采集的D患者血培养，分离出VV，而于其余3例患者（抗菌药物治疗后）采集的血标本均培养阴性。A、B患者疱液，以及C患者的伤口分泌物均分离出VV，阳性率高，适用于已应用抗菌药物治疗、血培养阴性者。实验亦证实，经伤口感染VV的小鼠，其血培养（12 h）阳性率仅为20%，而伤口分泌物培养阳性率为100%，感染6 h后即可在小鼠伤口分离出VV，并持续12～72 h［4］。标本保温送检并及时接种，棉拭子保湿送检，培养基置室温复温均影响细菌存活和培养阳性率。注射器抽取的疱液标本宜离心取沉淀物接种，以提高阳性率，或注入血培养瓶送检。送检同时告知必要的临床资料，以及标本直接涂片的染色镜检，有助于实验室选择合适的培养基并采取有针对性的鉴定程序，缩短报告时间。镜检发现G—杆菌且氧化酶阳性、TCBS平板上生长呈绿色菌落，判断分离到致病性弧菌，应作为危急值及时通知临床。

本组VV对多种抗菌药物敏感性较好，而对头孢唑林耐药或中介，对头孢替坦均为中介，仅1例对头孢吡肟耐药，与韦俊超等［5］报道的（分离自脓性分泌物）相近，与潘军航等［6］报道（分离自粪便样本）结果存在差异，后者对氨基糖苷类抗生素（如阿米卡星、庆大霉素）耐药；王志刚等［7］报道的临床分离株对庆大霉素、妥布霉素、氨曲南和头孢唑林耐药。VV表型复杂，不同来源分离株的耐药表型差异，抗菌药物治疗应结合药敏试验结果进行选择。同时，环境分离株的耐药现状不容乐观，海域分离株、患病鱼的分离株、部分海/水产品分离株等对多种抗菌药物，如青霉素类、磺胺类、头孢菌素类、氨基糖苷类抗生素耐药［4，8～9］。

及时就诊并尽早使用抗菌药物治疗是影响患者预后的关键。本组患者所应用抗菌药物，如亚胺培南/西司他丁、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦等均为敏感药物，因就诊时机不同而治疗效果出现差异。出现感染性休克者抗菌药物疗效不佳，患者A、B、D分别于2、11 d后死亡；患者C起病2 d后就诊，予头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等治疗有效。卢中秋等［10］认为，早期使用各类抗菌药物治疗均有效，但感染中晚期或严重感染时疗效较差。

由于患者一般情况差，血小板降低及凝血功能障碍等不利于截肢手术，控制局部感染灶，并清创去除坏死组织尤为重要。患者C起病后自行使用消毒剂（具体不详）频繁清洗患处，入院后经积极清创换药，局部敷聚维酮碘，病情逐渐稳定，于第47天行清创植皮术后痊愈。文献［5，11］报道，VV感染患者单纯行创口换药1个多月后好转，或经头孢曲松静脉滴注、呋喃西林局部湿敷治疗20 d后痊愈。一周后患者B下肢伤口分泌物、痰分别多次分离出鲍曼不动杆菌和白假丝酵母菌，提示应预防合并其他细菌及真菌感染。

铁是VV生长的必须营养，环丙沙星联合铁螯合剂和铁调素激动剂体外实验［12—13］提示，通过降低血清铁水平，可抑制VV生长，利于改善感染预后。输注压积红细胞的患者亦应及时去铁。

临床微生物实验室应熟练掌握VV培养特性、鉴定要点及流行特点，同时应提高送检意识，规范标本采集和送检程序。汕头地区素有食生腌贝甲类海鲜的习惯，应加强VV感染的科普宣教，规范海产品餐饮加工处理过程。对相关易感因素应采取有效防护措施，谨慎处理暴露于海水或接触海产品的患者伤口，并及时就诊。临床及水产养殖中应避免抗菌药物滥用，并加强VV耐药性监测。

表3　4例感染患者分离的VV药敏试验结果（μg/mL）Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of V. vulnificus isolated from4 infected patients（μg/ mL）

［1］ Jones MK，Oliver JD.Vibrio vulnificus：disease and patho-genesis［J］.Infect Immun，2009，77（5）：1723—1733.

［2］ Nakafusa J，Misago N，Miura Y，et al.The importance of ser-um creatine phosphokinase level in the early diagnosis，and as aprognostic factor，of Vibrio vulnificus infection［J］.Br J Dermatol，2001，145（2）：280—284.

［3］ Klontz KC，Lieb S，Schreiber M，et al.Syndromes of Vibrio vulnificus infections.Clinical and epidemiologic features in Florida cases，1981—1987［J］.Ann Intern Med，1988，109 （4）：318—323.

［4］ 马骢，郭建巍，郝秀红，等.中国海域分离的创伤弧菌的致病性及其对抗生素的敏感性研究［J］.第四军医大学学报，2009，30（6）：493—496.

［5］ 韦俊超，潘军航，李月华.一株新MLST型创伤弧菌的分离鉴定［J］.中国卫生检验杂志，2014，24（8）：1109—1115.

［6］ 潘军航，叶菊莲，朱敏，等.腹泻样本中创伤弧菌的检测分析［J］.疾病监测，2012，27（1）：59—61.

［7］ 王志刚，邵平扬，吴晓燕，等.创伤弧菌的培养鉴定及其对抗菌药物的敏感性［J］.中华临床感染病杂志，2009，2（5）：293—296.

［8］ 赵典惠，孙际芳，王海芳，等.创伤弧菌的药物敏感性［J］.中国人兽共患病学报，2007，27（12）：1207—1211.

［9］ 虞艳，潘军航，石亚素，等.多株创伤弧菌的基因分型和药敏试验［J］.疾病监测，2013，28（2）：136—139.

［10］卢中秋，洪广亮.创伤弧菌脓毒症诊治进展［J］.临床外科杂志，2011，19（3）：159—163.

［11］缪心军，蔡平平，陈玉熹，等.原发性创伤弧菌脓毒血症救治成功三例［J］.天津医药，2006，34（2）：136—137.

［12］Neupane GP，Kim DM.In vitro time-kill activities of cipro-floxacin alone and in combination with the ironchelator defera-sirox against Vibrio vulnificus［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（4）：407—410.

［13］Arezes J，Jung G，Gabayan V，et al.Hepcidin-induced hypoferre-mia is a critical host defense mechanism against the siderophilic bacteriumVibrio vulnificus［J］.Cell Host Microbe，2015，17 （1）：47—57.

（本文编辑：李春辉）

Laboratory analysis on 4cases of sporadic Vibrio vulnificus infection in Shantou City

CHEN Le-chuan1，ZHU Hong—jun1，ZHOU Ze-yan2，KE Yong—jian1，CHEN Chuan-wen1（1 Shantou Central Hospital，Shantou515031，China；2 Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou515144，China）

Objective To analyze characteristics of pathogenic microbiology and antimicrobial susceptibility of Vib-rio vulnificus（V.vulnificus）causing infection in patients at a hospital in Shantou City.Methods Four patients with V.vulnificus infection admitted to a hospital between June 2013 and June 2014 were analyzed retrospectively，blood specimens of patients were collected for culture，blister fluid and wound secretion were taken and inoculated on blood agar plates，MacConkey agar plates，and thiosulfate citrate bile salts sucrose（TCBS）plates，isolated strains were identified and performed antimicrobial susceptibility testing.Results Among 4 patients with V. vulnificus infection，3 died，1 was cured；patients developed primary septicemia and lower extremity infection be-cause of eating pickled crab，steamed scallop，or contacting with seafood products after trauma.Blister fluid from patients A and B，wound secretion from patient C，and blood from patient D were all isolated oxidase-positive gram-negative bacteria which produced green colonies on TCBS plate，these strains were identified as V.vulnificus，which were resistant or intermediate to cefazolin，intermediate to cefotetan，and 1 strain was resistant to cefepime. Conclusion Four patients infected with V.vulnificus have high mortality rate（3/4），positive rates of blister fluid and wound secretion are higher than blood；timely medical consultation，early antimicrobial therapy，and active de-bridement will help to cure the disease.

Vibrio vulnificus；antimicrobial susceptibility testing；drug resistance，microbial；drug resistance；foodborne infection；wound infection

R378

A

1671—9638（2016）04—0272—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.014

2015—03—18

陈乐川（1983—），男（汉族），广东省汕头市人，主管技师，主要从事临床微生物研究。

朱红军 Email：zhugdst@163.com