蓬子菜香叶木苷对大鼠细胞色素P450酶活性影响

崔明宇，王美薇，杨　柳，陈婷婷，孙　爽

(黑龙江中医药大学 药学院 哈尔滨 150040)



蓬子菜香叶木苷对大鼠细胞色素P450酶活性影响

崔明宇，王美薇，杨柳，陈婷婷，孙爽

(黑龙江中医药大学 药学院 哈尔滨 150040)

考察香叶木苷对大鼠细胞色素P450酶活性的影响. SD大鼠12只，雌雄各半，随机分为2组，分别为空白对照组与香叶木苷给药组(300 mg/kg)，连续灌胃7 d，于给药结束后次日制备肝微粒体，采用CO还原差示光谱法、紫外分光光度法测定大鼠细胞色素P450酶的质量浓度.香叶木苷给药组肝微粒体酶质量浓度明显高于空白对照组，组间差异P<0.05，差异显著.香叶木苷对大鼠肝微粒体P450酶具有诱导作用.

蓬子菜；香叶木苷；细胞色素P450酶

蓬子菜为茜草科拉拉藤属植物蓬子菜(Galium verum L.)的干燥全草，民间常作为活血化瘀药使用.香叶木苷(diosmin)是从蓬子菜中分离得到的黄酮苷类化合物，是蓬子菜活血化瘀作用的主要活性成分.临床用于肛门常见疾病、下肢慢性静脉功能不全、手术后水肿、糖尿病并发症、前列腺增生等疾病的治疗[1].现代药理研究表明，香叶木苷具有改善静脉通透性、增加静脉张力、改善微循环及诱导分化肝癌细胞的作用[2]，在静脉系统疾病及抗肿瘤方面具有很好的开发价值及应用前景.

药物对代谢酶活性的影响，是新药研究的重要组成部分，也是保证临床合理用药的关键.肝微粒体中细胞色素P450酶是药物代谢中最重要的酶系，可参与多数内源性物质与外源性药物的代谢，同时药物对细胞色素P450活性的诱导或抑制作用也是药物间相互作用的重要原因之一.本研究通过测定给药后大鼠细胞色素P450酶质量浓度的变化，探讨香叶木苷对细胞色素P450酶活性的影响，以期为香叶木苷的新药研究及临床合理用药提供参考，确保临床联合用药的安全与有效.

1　实验材料

1.1药品与试剂

香叶木苷对照品(Sigma公司，质量分数≥98%)，三羟甲基氨基甲烷(北京夏斯生物有限公司)，无水氯化钙(天津光复精细化工研究所)，磷酸二氢钾(天津市凯通化学试剂有限公司)，氢氧化钠(天津市瑞金特化学品有限公司)，连二亚硫酸钠(天津基准化学试剂有限公司)，甘油(天津基准化学试剂有限公司)，盐酸(天津市巴斯夫化工有限公司)，BCA试剂盒(碧云天生物技术公司)，CO(哈尔滨春林气体厂).

1.2实验仪器

低温高速离心机(BeckMan coulter，Allegra64R)，组织匀浆机(Sigma公司IKA，T10)，酶标仪(SpectraMax Plus384)，紫外分光光度计(ShimadzuUV-260).

1.3实验动物

SD大鼠(200±20)g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证：黑动字第P00101006.

2　方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1磷酸盐缓冲液(pH7.4)

取磷酸二氢钾 1.36 g加 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，即得.

2.1.2氯化钙溶液(88 mmol/L)

精密称取无水CaCl24.88 g，加入蒸馏水至500 mL定容.

2.1.3100 mmolTris-HCl缓冲液

0.2 mol/LTris溶液250 mL加入0.2 mol/L HCl10 mL 再加5.59 gKCl粉末加水至500 mL定容.

2.2分组及给药

取SD大鼠随机分为2组，分别为空白对照组及香叶木苷给药组，于实验室适应性喂养1周，香叶木苷给药组每天灌胃给予香叶木苷(300 mg/kg)，空白对照组灌胃给予等剂量的CMC-Na溶液，连续灌胃给药7 d，最后一次给药后禁食12 h.

2.3大鼠肝微粒体的制备

将连续给药7 d并禁食12 h后的大鼠断头处死，迅速剖开大鼠腹部，进行肝门静脉插管，以预冷的生理盐水灌流肝脏，清除肝中淤血直至变为蜡黄色为止，取出肝脏，置冰浴冷却的生理盐水中，除去肝脏表面血渍，并以滤纸吸干水分.将洗净的肝脏以Tris-HCl缓冲液反复清洗后，将大鼠肝组织剪成碎片，以4倍肝组织重量的Tris-HCl缓冲液在冰浴中制成匀浆，将得到的匀浆液转移至离心管中，于冷冻离心机中离心20 min后弃去沉淀(4 ℃，14 000 r/m)，取上清液，上清液即为线粒体后上清液(S9)[3-4].取线粒体后上清液以每毫升加入0.1倍体积氯化钙溶液 (88 mmol/L)的比例混合，置冰浴中5 min，期间轻轻振摇几次，然后在4 ℃、27 000 r/m下离心20 min，去除上清液，剩余下层沉淀物再用Tris-HCl缓冲液混合，于27 000 r/m离心20 min(4 ℃)，得到的下层悬浮物即是大鼠肝微粒体悬液，-70 ℃低温保存.

2.4肝微粒体总蛋白质量浓度的测定

2.4.1血清蛋白标准曲线制备

取0.8 mL蛋白标准配制液加入蛋白标准(20 mg BSA)中，充分溶解后得到25 mg/mL的蛋白标准溶液.取适量25 mg/mL蛋白标准溶液，稀释至终质量浓度为0.5 mg/mL.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀.将标准蛋白液用生理盐水稀释得一系列质量浓度的标准蛋白储备液，于562 nm处测吸光度，以吸光度对蛋白质质量浓度进行线性回归，制备牛血清白蛋白标准曲线.

2.4.2肝微粒体总蛋白质量浓度的测定

将大鼠肝微粒体混悬液稀释一定的倍数，取稀释后的混悬液20 μL加200 μL BCA工作液混匀，室温放置2 h后在562 nm处测定吸光度，根据标准曲线及稀释倍数计算肝微粒体混悬液中总蛋白质量浓度[4-5].

2.5肝微粒体CYP450酶质量浓度的测定

利用Omura法测定肝微粒体CYP450酶质量浓度，将已知蛋白质量浓度的肝微粒体样品以KCl-磷酸缓冲溶液稀释至0.5 mg/mL，分别取2.0 mL置于样品池和参比池，在400～500 nm全波段扫描；另取少量连二亚硫酸钠，轻微搅拌，2 min后等分到样品池和参比池中，缓慢向样品池中通入CO 1 min，室温下放置3 min后放入检测区域，测定450、490 nm处的吸光度值(n=6).

3　实验结果

3.1牛血清蛋白标准曲线

以蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为：A= 0.688 9C+ 0.110 1(R2= 0.996 6)，结果表明牛血清白蛋白在 0～0.5 mg/mL 范围内线性关系良好，符合大鼠肝微粒体质量浓度测定的要求.

3.2肝微粒体CYP450酶质量浓度测定结果

酶质量浓度测量正常对照组平均为0.193±0.00 6，香叶木苷给药组平均为0.324 7±0.062 4，组间差异检验P=0.023<0.05，差异显著，说明香叶木苷给药组酶质量浓度高于正常对照组.

表1香叶木苷给药组、空白对照组P450酶质量浓度与蛋白质量浓度

测量指标正常对照组(n=6)香叶木苷给药组(n=6)PP4500.193±0.00760.3247±0.06240.023*蛋白质量浓度2.8696±0.12612.1255±0.47280.047

注：*P<0.05

图1　香叶木苷给药组和正常对照组P450酶质量浓度差异

4　讨　论

细胞色素P450是肝微粒体中最重要的混合功

能氧化酶，可参与激素、脂肪酸等内源性物质及药物、前致癌物、前毒物等外源性物质的代谢过程，其催化活性取决于酶的质量浓度水平，故可从酶质量浓度的变化推断酶活性被诱导或抑制.本研究初步考察了香叶木苷对大鼠肝微粒体CYP 450 酶系的影响，通过观察连续给药七天后，香叶木苷给药组和空白对照组酶质量浓度的变化，判断香叶木苷对P450酶活性的影响.结果表明，香叶木苷给药组可明显提高大鼠肝微粒体总CYP450酶的质量浓度，说明香叶木苷对大鼠肝微粒体CYP450酶活性有诱导作用，同时对临床联合用药可能存在潜在的影响.在此实验基础上，可进一步采用cocktail法探讨香叶木苷对CYP1A2、CYP3A4、CYP2A9等与药物代谢密切相关酶的影响，对提高临床联合用药水平及阐明在代谢环节上发生的药物相互作用具有重要意义.

[1]陈伟兰, 钟惠青, 卢秋桃. 地奥司明的临床研究进展[J]. 基层医学论坛, 2012, 16(2): 515-516.

[2]马英丽, 马超. 香叶木苷在大鼠体内的药代动力学研究[J].中国中药杂志, 2007, 32(5): 418-420.

[3]胡东华, 王宇光, 陈志武, 等. 复方丹参滴丸对大鼠肝细胞色素P450酶的影响[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2013, 7(4): 1340-1341.

[4]朱曼, 王睿, 张永青, 等. 大鼠肝微粒体细胞色素P450酶系检测方法学研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2004, 9(5): 500-503.

[5]简暾煜, 徐帆, 廖春龙, 等. 三种方法测定大鼠蛋白含量比较[J]. 中国药师, 2011, 14(3): 342-344.

Effect of diosmin from Galium verum L. on activity of cytochrome P450 enzymes in rat liver microsomes

CUI Ming-yu, WANG Mei-wei, YANG Liu, CHEN Ting-ting, SUN Shuang

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To study the effect of diosmin on the activity in rat cytochrome P450 enzyme twelve SD rats were randomly divided into two groups, half male and half female. The blank control group and diosmin administration group (300 mg/kg) were administered by intragastric for seven days in a row. The extracts of the liver tissues of rats were in preparation of microsomes. The activity of total CYP450 was determined by the reduction of CO difference spectroscopy and spectrophotometer method. Results indicated that compared with blank control group, contents of CYP450 enzyme were increasing obeviously in diosmin group (P<0.05). Diosmin could induce the CYP450 enzyme in the liver tissues of rats.

Galium verum L; diosmin; cytochrome P450 enzymes

2015-09-02.

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531625)；黑龙江省自然科学基金面上项目(H2015044);黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(2015)

崔明宇(1971-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分及其药物动力学研究.

R285

A

1672-0946(2016)04-0406-03