理冲生髓饮中多糖及水溶性蛋白质的质量分数测定

王艳宏, 王　超 , 尚冬雪 , 李　洋 , 赵永伟, 韩凤娟

(1. 黑龙江中医药大学 药学院 药剂学教研室，哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学 附属第一医院 妇科一科，哈尔滨 150040)



理冲生髓饮中多糖及水溶性蛋白质的质量分数测定

王艳宏1, 王超1, 尚冬雪1, 李洋1, 赵永伟1, 韩凤娟2

(1. 黑龙江中医药大学 药学院 药剂学教研室，哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学 附属第一医院 妇科一科，哈尔滨 150040)

建立理冲生髓饮中多糖及水溶性蛋白质质量分数测定的方法.测定理冲生髓饮多糖对葡萄糖的换算因子，利用苯酚-硫酸法测定多糖的质量分数；采用考马斯亮蓝G- 250染色法测定理冲生髓饮中可溶性蛋白质的质量分数.多糖标准曲线方程为A=12.839C-0.008 5(r=0. 999 3)，蛋白质标准曲线方程为A=1.271C-0.033 1(r=0. 999 2)，两者分别在 0.01～0.1、0.1～1.0 g/L有良好的线性关系.测得理冲生髓饮中多糖质量分数为8.53%，水溶性蛋白质质量分数为0.35%.该两种方法操作简便、灵敏、快速、准确，重复性好，可用于理冲生髓饮中多糖、水溶性蛋白质的质量分数测定.

理冲生髓饮；多糖；水溶性蛋白质；质量分数测定

理冲生髓饮是在国家老中医、黑龙江省名中医王秀霞教授在长期妇科临床实践中总结而出有效方剂的基础上，结合现代制剂技术制备得到的现代中药制剂.其由人参、黄芪、鹿茸、莪术、三棱、淫羊藿、浙贝母、水蛭八味中药材组成，具有破血消癥、软坚散结、补气养血、填精益髓之功，可用于治疗卵巢癌[1-7].理冲生髓饮中所含的成分种类众多，有挥发油类、皂苷类、黄酮类、多糖类成分等.其中人参、黄芪等含有的多糖类成分具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等活性[8-11].此外，人参水溶性蛋白具有调血脂、抗疲劳、抗辐射、抗真菌以及抗病毒等作用[12-15]，鹿茸水溶性蛋白质具有抗炎镇痛、促进创伤愈合以及抗肿瘤等多种生物活性[16-17].为了有效的控制产品质量，保证临床疗效，本文采用苯酚-硫酸法，考马斯亮蓝G-250染色法分别对理冲生髓饮中多糖、水溶性蛋白质进行了质量分数测定.

1　材料

紫外可见光分光光度计(WFZ UV-4802H，上海尤尼柯仪器有限公司)，分析天平(AB265-S，瑞士METTLER TOLEDO公司)，真空冷冻干燥机(BenchTop K，美国VIRTIS公司)，旋转蒸发仪(N1100-OSB-2100，上海爱朗仪器有限公司)，牛血清白蛋白( AR级，上海沥瑞生物科技有限公司，批号201421)，无水葡萄糖(AR级，中国食品药品检定研究院，批号110833-201205)，考马斯亮蓝G-250(AR级，上海源叶生物科技有限公司，批号201307)，实验用水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯.理冲生髓饮方中各药由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，经黑龙江中医药大学孙慧峰教授鉴定均符合药典2010版各项下药材规定.

2　方法与结果

2.1理冲生髓饮的制备

取处方量的药材，适当粉碎，以SCFE法萃取，获得萃取物；药渣继续以75%乙醇回流提取，提取液回收乙醇后浓缩至150 mL；药渣挥尽溶剂后，继续以水回流提取，水提液浓缩后，与上述浓缩液合并，加入萃取物，搅匀，即得.

2.2多糖的质量分数测定

2.2.1供试品溶液的制备

精密移取理冲生髓饮减压浓缩至150 mL，加乙醇至最终体积分数为75%，于4 ℃冰箱中静置过夜，离心(4 000 r/min,15 min)，将沉淀冷冻干燥，即得理冲生髓饮粗多糖.取粗多糖以水复溶，Sevag法除蛋白至水层在280 nm处无紫外吸收[18].将水层浓缩后，用过氧化氢脱色，然后将脱色后的溶液装入透析袋中透析，透析液减压浓缩后，加乙醇至最终浓度(体积分数)为75%，冷藏静置过夜，离心，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，冷冻干燥，即得精制理冲生髓饮多糖[19].

取理冲生髓饮粗多糖10 mg，精密称定，加水定容至100 mL量瓶中，作为供试品溶液.

2.2.2对照品溶液的制备

取105 ℃干燥至恒重葡萄糖对照品适量，精确称定，加水制成每L含有0.1 g葡萄糖的对照品贮备液，再分别移取2.5、5、10、15、20 mL的对照品贮备液置25 mL量瓶中，加水制得相应质量浓度分别为0.01、0.02.、0.04、0.06、0.08、0.1 g/L的葡萄糖系列对照品溶液.

2.2.3苯酚溶液的制备

称取分析纯苯酚200 g，加铝片0.2 g、碳酸氢钠0.1 g，常压油浴蒸馏，收集182 ℃馏份.称取该馏份80 g，加水溶解并稀释成80%苯酚液，冷藏备用.临用前，精密移取 3.125 mL的80% 苯酚溶液，置50 mL 容量瓶中，加水定容，即得 5% 苯酚液.

2.2.4测定吸收波长的选择

精确移取标准溶液和供试品溶液各1.00 mL，以蒸馏水作空白，分别置于20 mL具塞试管中，并依次加入5%苯酚溶液1.0 mL，振摇混匀，迅速滴加5.0 mL浓硫酸，摇匀，室温下放置30 min，然后采用分光光度计上，于400～600 nm波长范围进行扫描，检测到两种溶液最大吸收峰所对应的波长均为489 nm，故选择489 nm作为测定理冲多糖质量分数的检测波长.

2.2.5标准曲线的绘制

分别精密移取1.0 mL葡萄糖系列对照品溶液，以蒸馏水作空白，分别置于20 mL具塞试管中，按照2.2.4项下的方法，于489 nm处测定吸光度，以葡萄糖标准液质量浓度(C)为横坐标，吸收值(A)为纵坐标，绘制标准曲线.标准曲线方程A=12.839C-0.008 5 (r=0.999 3)，在0.01～0.1 g/L范围内的线性关系良好.

2.2.6换算因子的计算

精密称取精制理冲生髓饮多糖10.00 mg，加水定容至100 mL量瓶中，摇匀得多糖的储备液.吸取多糖储备液20.0 mL，置于25 mL量瓶中，加水定容.精密移取上述溶液1.0 mL于具塞试管中，按照2.2.4项下的方法测定吸光度，根据标准曲线计算其中多糖质量浓度.按f=W/(C×D)计算换算因子.其中W为精制多糖的质量(mg)，C为精制多糖中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)，D为稀释因素，测得f=1.648 8，RSD为2.17%(n=5).

2.2.7样品的质量分数测定

精密移取供试品溶液1.0 mL，按照2.2.4项下的方法测定其吸光度值，计算多糖质量分数.多糖质量分数(%)=(C×D×f/W)×100%，其中：C为供试品溶液中葡萄糖的质量浓度，D为稀释因素，f为换算因子，W为供试品质量.结果测得理冲生髓饮粗多糖部位中多糖的质量分数为87.58%，RSD为 1.52% (n=6).再乘以得率9.74%，得复方中平均多糖质量分数为8.53%.

2.2.8加样回收实验

精密移取9份2.2.1项下已知质量分数的粗多糖供试品溶液各 0.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，并分别加入质量浓度为0.04、0.06 和 0.08 g/L的葡萄糖标准系列溶液各 0.5 mL，加水定容，每个质量浓度平行3份，按照2.2.4项下的方法测定吸光度.结果如表1所示，测得平均加样回收率为99.35%，RSD为1.41%，试验结果表明，平均回收率在 97%～101%之间，上述方法具有良好的回收率.

表1　理冲生髓饮多糖加样回收率结果

2.2.9精密度实验

精密移取理冲生髓饮粗多糖供试液1.0 mL，按照2.2.4项下标准曲线绘制的方法测定吸光度，平行测定6份，RSD为1.63%，表明此方法精密度良好.

2.2.10稳定性实验

精密移取理冲生髓饮粗多糖供试液1.0 mL，按照2.2.4项下标准曲线绘制的方法测定吸光度，每隔0.5 h测一次吸光度，连续11次，结果表明样品显色后在5 h内稳定性良好，RSD为1.25%.

2.3水溶性蛋白质质量分数测定

2.3.1供试品溶液的制备

移取理冲生髓饮浓缩至100 mL，作为供试品溶液.

2.3.2蛋白质标准溶液的制备

取干燥至恒重的牛血清白蛋白10.00 mg，精密称定后，加水制成每1升含有蛋白质1.0 g的蛋白质标准储备液，并冷藏保存.

2.3.3考马斯亮蓝G-250溶液的制备[20]

精密称取考马斯亮蓝 G-250 100.00 mg，加50 mL 的95% 乙醇溶解后(显蓝色)，再加入100 mL的85%(m/V)磷酸(显血红色)，最后加蒸馏水制得每1 L含100.00 mg考马斯亮蓝显色液.

2.3.4测定吸收波长选择

分别精密移取供试品溶液及标准品溶液各0.1 mL，置10 mL 具塞试管中，分别加入5.0 mL考马斯亮蓝显色液，立即混匀，放置 10 min后，采用分光光度计，于500～800 nm 区间扫描，结果测得标准品与供试品均在595 nm 处有最大吸收，故选择 595nm 为测定蛋白质质量分数时的检测波长.

2.3.5标准曲线的绘制[20]

精密量取蛋白质对照品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，并编号为1～7号，分别加入水至1.0 mL，摇匀，得到相应质量浓度分别为0.0、0.1.、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的蛋白质标准系列溶液.然后从各管中吸取溶液0.10 mL，按2.3.4项下的方法，于595 nm处测定吸光度，同时以1号管作为空白对照.以蛋白质标准液质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线.标准方程A=1.271C-0.033 1(r=0.999 2)，在0.1～1.0g/L范围内的线性关系良好.

2.3.6水溶性蛋白质质量分数测定

精密移取0.1 mL供试品溶液，置于具塞试管中，按2.3.4项下的方法测定吸光度，计算水溶性蛋白质质量分数.蛋白质的质量分数(%)=(C×D/W)×100%，其中：C为供试液中蛋白质质量浓度(g/L)，D为稀释因素，W样品的质量(g).结果测得理冲生髓饮中水溶性蛋白质质量分数为0.35%，RSD2.43%(n=6).

2.3.7加样回收实验

精密移取9份2.3.1项下已知质量分数的供试品溶液 0.05 mL( 蛋白质量分数为0.3549%) ，分别加入质量浓度为0.2、0.4 和 0.6 g/L 蛋白质标准系列溶液各 0.05 mL，按2.3.4项下的方法测定吸光度，结果如表2，测得平均回收率为100.2%，RSD为1.89 %，试验结果表明，平均回收率在 98%～102%之间，上述方法具有良好的回收率.

表2　理冲生髓饮蛋白质加样回收率结果

2.3.8精密度实验

精密移取供试液0.1 mL，按2.3.4项下的方法测定吸光度，平行测定6份，RSD为 1.37%，表明此方法精密度良好.

2.3.9稳定性实验

精密移取供试液0.1 mL，按2.3.4项下的方法测定吸光度，每隔5 min测定一次吸光度，连续10次，结果表明样品显色后在45 min内稳定性良好，RSD为1.74%.

3　讨　论

本文分别采用苯酚-硫酸法测定多糖和考马斯亮蓝G- 250染色法测定水溶性蛋白质的质量分数.苯酚-硫酸法是用于测定多糖质量分数的常用方法，具有操作简便，灵敏度高，重现性好的特点，其原理是多糖在浓硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色物质，该有色物质有紫外吸收，因此可用比色法测定其多糖质量分数.理冲生髓饮中多糖种类较多，成分复杂，若仅使用葡萄糖一种单糖作标准曲线，会造成较大的误差，所以本实验利用精制多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子，以减小单纯以葡萄糖为标准计算多糖质量分数带来的误差，使测得值更接近于真实值.

蛋白质是人体必需的营养物质，也是中药的一类有效成分，而目前有关中药材中的蛋白质的分析，则仅限于分析其中的水溶性的蛋白质.考马斯亮蓝G-250染色法的原理是蛋白质分子中的酰胺基团与考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中结合成蓝色复合物，在595 nm处有紫外吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可测定1～200 μg蛋白质质量分数.本法灵敏度高于凯氏定氮法、Lowry法，且操作简便，重复性好[21-22].

理冲生髓饮可抑制卵巢癌组织的生长和转移，对卵巢癌的治疗有一定的独特的疗效.其中，多糖和蛋白质均为该复方中治疗卵巢癌的物质基础，因此本文分别建立了多糖、蛋白质质量分数测定的方法，为理冲生髓饮的质量标准的制定提供依据.

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Determination of polysaccharide content and protein content in Lichong Shengsui Drink

WANG Yan-hong1, WANG Chao1, SHANG Dong-xue1, LI Yang1, ZHAO Yong-wei1, HAN Feng-juan2

(1. Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2 First Gynecological Department, First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To establish a method for the determination of polysaccharide and water-soluble protein in Lichong Shengsui Drink (LCSSD), the conversion factor of LCSSD polysaccharide to glucose was obtained with refined polysaccharide, and the content of LCSSD polysaccharide was determined by using phenol- sulfuric method. The content of protein was determined by using the dying method with Coomassie brilliant blue G -250. The polysaccharide standard curve equation wasA=12.839C-0. 008 5 (r=0. 999 3) and protein standard curve equation wasA=1.271 0C-0. 033 1 (r=0. 999 2). Respectively the linear range was 0.01～0.1 g/L and 0.1～1.0 g/L. The content of polysaccharide was 8.53%, and the content of protein was 0.35%. The method is simple, fast, accurate and reproducible, and it should be helpful for the determination of polysaccharide and water-soluble proteins in LCSSD.

Lichong ShengSui Drink; polysaccharide; water-soluble protein; content determination

2015-11-26.

国家自然科学基金项目(81273788)

王艳宏(1972-)，女，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：中药性味理论和中药制剂现代化.

韩凤娟(1971-)，女，博士，教授，主任医师，硕士、博士研究生导师，研究方向：中西医结合诊治妇科肿瘤

R286

A

1672-0946(2016)04-0399-04