红景天多糖的提取及体外抗氧化活性研究

林晓月，齐珈娆，王丹丹，任　婷，佟海滨，孙　新

（1.北华大学药学院，吉林吉林　132013；2.吉林省分子老年医学重点实验室，北华大学生命科学中心，吉林吉林　132013）

红景天多糖的提取及体外抗氧化活性研究

林晓月1，2，齐珈娆2，王丹丹1，任婷1，佟海滨2，孙新2

（1.北华大学药学院，吉林吉林132013；2.吉林省分子老年医学重点实验室，北华大学生命科学中心，吉林吉林132013）

目的优化红景天多糖的制备工艺，并系统评价红景天多糖清除自由基的能力.方法采用正交设计方法优化红景天多糖提取工艺，以多糖提率为考察指标，比较不同固液比、提取温度、提取时间、提取次数对多糖提取效果的影响；通过反复冻融、透析及酶-sevag联合脱蛋白法，纯化制备红景天多糖（RSP）；采用苯酚-硫酸法、红外色谱仪及紫外-可见分光光度计对红景天多糖的基本理化性质进行表征；利用体外抗氧化模型评价红景天多糖对1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（·）自由基的清除能力.结果红景天多糖的最佳提取条件固液比为1∶20，提取温度为90℃，提取时间为3 h，提取次数3次.此外，红景天多糖对DPPH·和·OH具有较好的清除能力.结论成功确立红景天多糖的最佳提取工艺，红景天多糖具有一定的抗氧化作用.

红景天多糖；提取；纯化；清除自由基

【引用格式】林晓月，齐珈娆，王丹丹，等.红景天多糖的提取及体外抗氧化活性研究［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）:330-334.

红景天属于景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物，广泛分布在亚洲中部和北部、欧洲中部和东南部以及北极，多生长在高山岩石缝隙或灌木丛中［1］.在传统医学中，红景天多用于刺激神经系统、消除疲劳、减少抑郁和防止高原病等［2］.大量研究表明:红景天含有多种有效成分，如多糖类、苷类、酪醇、红景天素、酚类、黄酮类、氨基酸类、香豆素类、有机酸类、矿物质元素、甾体化合物和生物碱类等［3-5］.红景天多糖具有抗疲劳［6］、抗衰老［7］、抗病毒［8］、降血糖［9］、调节免疫力［10］等功效，因其具有广泛的药用价值，已成为近年来研究开发的热点.植物多糖提取常采用热水浸提，但温度过高或过低都会降低多糖的提取率.除此之外，固液比、提取时间、提取次数也会影响多糖的提取率，即采用四因素三水平的正交设计方案，优选出红景天多糖的最佳提取工艺.红景天多糖的抗氧化功效尚未见系统评价，为深入评价并揭示红景天多糖的抗氧化能力及可能机制，本研究检测了红景天多糖对1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（·）的清除能力，为综合开发利用红景天资源提供科学依据.

1　仪器与材料

1.1实验材料

长白山红景天的干燥根茎.

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器

电子天平（JA2003N）、高速粉碎机、电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，HHS型）；台式多用离心机（HERMLE，Z323K）、台式冷冻离心机（Allegra 64R）、鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）、HY-2调速多用振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；双光束紫外/可见分光光度仪（CARY100Conc，VARIAN）；超纯水器（Barnstead Easypure）；冷冻干燥器（EZ585，SIM）.

1.2.2试剂

无水乙醇（北京化工化学试剂公司）；乙醚（天津市凯信化学工业有限公司）；氯仿（天津市凯信化学工业有限公司）；正丁醇（国药集团化学试剂有限公司）；链霉素蛋白酶（Sigma）；苯酚（ALORICH）；硫酸（哈尔滨试剂化工厂）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京鼎国生物技术有限公司）；1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（Sigma）、维生素E（Biotopped）、邻苯三酚（北京鼎国试剂公司）；硫酸亚铁（天津福星化学试剂厂）；水杨酸（国药集团化学试剂厂）；纯净水.

2　实验方法

2.1标准曲线的绘制

2.1.1葡萄糖标准品的制备

精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100mg，放入容量瓶，纯净水溶解并定容至100mL，混匀后，准确量取10mL该溶液置于100mL容量瓶中，并加入纯净水稀释定容，即配制成浓度为100μg/mL葡萄糖标准液备用.

2.1.2标准曲线的绘制

分别精密量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL葡萄糖标准液置于试管中，加纯净水至1mL，依次加入0.5mL 6%苯酚和2.5mL浓硫酸，剧烈震荡后，置于沸水浴中加热10 min后，室温静置20 min，在490 nm处测定吸光度值.以葡萄糖浓度为横坐标（x），光密度为纵坐标（y），绘制标准曲线，得回归方程为y=0.014 9x+0.020 0，R2=0.999 4.结果表明:葡萄糖标准液在10～100μg/mL之间呈良好的线性关系.

2.1.3精密度试验

精密吸取供试品溶液1mL，置于试管中，共6份，同2.1.2操作，测定吸光度，考察实验精密度.实验结果为RSD=1.5%，表明实验精密度良好.

2.1.4稳定性试验

精密吸取1mL供试品溶液，置于试管中，参照

2.1.2操作，在490 nm处每隔10 min测一次吸光度，RSD=0.08%，在1 h吸光度基本保持不变.结果表明:供试品溶液在1 h内稳定性良好.

2.1.5加样回收率

精密吸取已知多糖含量的供试品溶液0.5mL，置于试管中，共6份，再分别加入已知含量的葡萄糖标准液0.5mL，同2.1.2操作，根据回收率=（实际测得量-供试品所含被测含量）/加入葡萄糖量× 100%.结果表明:红景天多糖的平均回收率为98.1 9%，RSD=1.91%.

2.1.6红景天多糖含量测定

准确称取红景天粗多糖5mg，用纯净水溶解，定容至100mL，作为待测样品溶液，按照上述葡萄糖标准曲线方法，测定溶液的吸光度，根据下列公式计算多糖含量:

式中:C为一定浓度下多糖所测吸光度所对应的葡萄糖浓度；V为加入的多糖体积；W为生药的质量；多糖得率=粗多糖量×多糖含量÷取样量×100%.

2.2红景天多糖的提取

精密称取20 g红景天粉末9份，按照正交设计方案进行提取，合并水提液，过滤，滤液浓缩到适当体积，加无水乙醇至乙醇终浓度为80%，4℃过夜，醇析，离心（10min，4 500 r/min），用90%及95%的无水乙醇、乙醚梯度洗脱，离心（10min，4 500 r/min），得到沉淀，室温干燥得到红景天粗多糖.

表1　红景天多糖提取的因素水平Tab.1　Factor levels of Rhodiola rosea polysaccharide extraction

2.3红景天多糖的纯化

通过正交试验方法确定最佳提取工艺后得到的红景天粗多糖，用双蒸水水溶至浓度为5%的多糖溶液，放入-80℃冷冻过夜，室温融化，离心（12 000 r/ min）10min，取上清，重复多次，至无沉淀析出为止. 按V（酶）∶V（蛋白）=1∶50的比例将链霉菌蛋白酶加入糖溶液混匀，将其分装放入透析袋中（截留分子量3 000 Da），以1%氯化钠作为透析外液，滴两滴二甲苯封闭，37℃孵育24 h，期间更换透析液4次.将Sevag试剂（V（三氯甲烷）∶V（正丁醇）=4 ∶1，总体积为多糖水溶液体积的1/3）加入酶法水解后的多糖溶液中，剧烈震荡30min，离心，去除游离蛋白产生的凝胶状沉淀，重复上述操作多次，直至中层无凝胶状沉淀，经冷冻干燥后，得到红景天总多糖（RSP）.

2.4红外、紫外光谱分析

红外光谱:取适量红景天总多糖，用KBr压片后，测定红外光谱吸收程度.

紫外光谱:配成50μg/mL的红景天多糖溶液，在波长190～800 nm范围内扫描.

2.5红景天多糖体外抗氧化活性研究

2.5.1对1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）清除率的测定

在96孔板中依次加入150μL不同浓度的红景天多糖溶液或维生素E溶液，加入2×10-4mol/L的DPPH·无水乙醇溶液150μL，室温反应30min，于波长517 nm处测定吸光度，按照以下公式计算DPPH·的清除率:

其中:A0为水代替多糖时测得的吸光度；Ai为不同多糖溶液测得的吸光度；Aj为乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液测得的吸光度.

2.5.2对羟基自由基（·OH）清除率的测定

在96孔板中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液50μL、不同浓度的多糖溶液或维生素E溶液50μ L，以及6mmol/L 30%的H2O2溶液50μL，摇匀，静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸溶液50μL，摇匀，静置30min后，于510 nm处测其吸光值.

其中:A0为用水代替多糖时测得的吸光值；Ai为不同多糖浓度下测得的吸光值；Aj为用水代替水杨酸时不同多糖浓度下测得的本底吸光值.

10mL比色管中依次加入4.5mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH为8.2），不同浓度的红景天多糖溶液或维生素E溶液1mL，蒸馏水2.4mL，混匀，25℃下保温10min.再加入0.1mL 6mmol/L邻苯三酚，计时，摇匀，准确反应3min后，加入10mol/L HCL溶液0.1 mL，终止反应，以双蒸水为对照，在325 nm下测定吸光值A.

其中:A0为用水代替多糖时测得的吸光值；A1为不同多糖浓度下测得的吸光值；A2为用水代替邻苯三酚时不同多糖浓度下测得的本底吸光值.

3　结果与分析

3.1最佳提取条件的选择

通过极差分析，如表2，表3所示:RC＞RB＞RD＞RA，即各因素对红景天多糖提取的影响率大小为提取时间＞提取温度＞提取次数＞固液比，其提取时间对红景天多糖的提取影响最为显著.结果显示:红景天多糖最佳提取条件为A3B2C3D3，即固液比1 ∶20，提取温度为90℃，提取时间3 h，提取次数3 次.按最佳提取工艺A3B2C3D3进行验证试验，测得多糖含量为29.2%，多糖得率为7.04%.

表2　红景天多糖的正交实验结果Tab.2　Orthogonal experimental results of Rhodiola rosea polysaccharide

表3　方差分析结果Tab.3　Results of variance analysis

3.2红外光谱分析

如图1所示:样品在3 417，2 956，1 743，1 439，1 266，1 102，835 cm-1等处有多糖的特征吸收峰，3 417 cm-1处的吸收峰为羟基伸缩振动，2 956 cm-1处的吸收峰为碳氢伸缩振动，1 743 cm-1处吸收峰为糖醛酸的特征吸收峰，表明红景天多糖可能是一种酸性多糖.1 102 cm-1处吸收峰为碳氧伸缩振动，1 0 78 cm-1和1 019 cm-1处为吡喃环特征吸收峰，835 cm-1处的吸收峰为α-吡喃糖苷键的特征吸收峰.

3.3紫外光谱分析

如图2所示:经脱蛋白后的红景天多糖紫外吸收光谱在280 nm处无吸收峰，说明蛋白被除尽.

3.4对DPPH·的清除作用

如图3所示:在实验浓度范围内，红景天多糖、维生素E对DPPH·的清除率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性，且红景天多糖对DPPH·的清除作用强于维生素E.红景天多糖DPPH·的IC50为29.37μg/mL，在浓度为120μg/mL时红景天多糖对DPPH·的清除率已达到88.9%，而维生素E 对DPPH·的IC50为111.42μg/mL.研究结果表明:红景天多糖对DPPH·有较强的清除作用，且清除效率要强于维生素E.

3.5对·OH的清除作用

如图4所示:红景天多糖对·OH的清除作用强于维生素E，且对·OH的清除作用随着浓度的增加而增加.在浓度为1mg/mL时，红景天多糖对·OH的清除率已达到57.7%，其对·OH的IC50为0.05mg/mL，而维生素E对·OH的IC50为11.47 mg/mL.在浓度为6mg/mL时，红景天多糖对·OH的清除率达到73.1%.研究结果表明:红景天多糖对·OH有较强的清除作用.

4　讨　论

多糖因其广泛的生物学活性成为21世纪研究的热点，其种类繁多，包括植物多糖、动物多糖、真菌多糖等，其中植物多糖研究最为广泛，因其特殊的生物活性和理化性质，广泛应用于医药、保健、美容、食品、农业、石油等行业［11-12］.

热水浸提是提取植物多糖常用的方法，操作简便，条件温和，污染少.本实验采取正交试验，优化影响红景天多糖提取的固液比、提取温度、提取时间、提取次数，得到最佳提取工艺，最后按照最佳工艺进行提取，得到红景天多糖的含量为29.2%，红景天得率为7.04%.近年来一些新型提取技术也陆续出现，如微波法［13］、超声法［14］、超临界萃取法［15］、亚临界水萃取技术［16］等，但由于多糖结构组成复杂、种类多、分子量大、极性大等特点，单一的提取方法各有利弊，不一定能获得最佳效果，结合两种或两种以上提取方法提取，可能会得到更好的效果.

近年来研究发现:通过热水浸提与超声波、微波结合提取植物多糖能够缩短提取时间，提高提取率，产物纯度高［17-18］，这种联合提取技术值得我们进一步研究，以便得到最佳提取技术，尽可能提高多糖得率.为更好地开发多糖的生物活性，通过建立模型，测定红景天多糖对清除作用.结果表明:红景天多糖对有较好的清除作用，但对的清除作用相对较弱.研究结果显示:红景天多糖有一定的体外抗氧化作用.

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【责任编辑：陈丽华】

Study on the Extraction of Polysaccharide from Rhodiola Rosea and Its Antioxidant Activity in Vitro

Lin Xiaoyue1，2，Qi Jiarao2，Wang Dandan1，Ren Ting1，Tong Haibin2，Sun Xin2
（1.Pharmacy College of Beihua University，Jilin 132013，China；2.Jilin Key Laboratory of Molecular Medicine for the Elderly，Life Science Research Center of Beihua University，Jilin 132013，China）

ObjectiveTo establish the optimum process for the extraction of Rhodiola rosea polysaccharides （RSP），and to evaluate their free radical scavenging capacities.MethodThe optimum extraction conditions were obtained by orthogonal experiment design.Taking the crude polysaccharide content as index，the influences of solidliquid ratio，extraction temperature，extraction time，extraction times on the extraction efficiency were compared.The proteins in Rhodiola rosea polysaccharides were removed by repeated freezing and thawing，dialysis，and enzymesevag method，in order to acquire relatively pure polysaccharides.The basic physical and chemical properties of Rhodiola rosea polysaccharides were characterized by phenol-sulfuric acid method，infrared chromatography and UV-visible spectrophotometer.The antioxidant system was introduced in vitro.The scavenging effects of Rhodiola rosea polysaccharides on three free radicalswere determined，including 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH·），hydroxyl radical（·OH）and superoxide anion（·）.ResultsThe optimal extraction conditions were as follows:solid-liquid ratio of 1∶20，extraction temperature of 90℃，3 extraction times，extraction time of 3 h.In addition，Rhodiola rosea polysaccharides exhibited excellent scavenging abilities on DPPH· and·OH free radicals.ConclusionOptimum extraction technology of Rhodiola rosea polysaccharide is successfully established，in addition，Rhodiola rosea polysaccharides have certain antioxidant effect.

Rhodiola rosea polysaccharide；extraction；purification；free radical scavenging

R28

A

1009-4822（2016）03-0330-05

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.010

2015-12-09

吉林省科技发展计划项目（20111809；20130624003JC；20140312043ZG；20150312013ZG）.

林晓月（1989-），女，硕士研究生，主要从事药物化学研究，E-mail:linxi.aoyue@163.com；通信作者:孙新（1967-），女，博士，教授，硕士生导师，主要从事分子老年医学研究，E-mail:sunxinbh@126.com.