临床来源副溶血弧菌毒力基因及耐药性分析

周方满，谢红意，叶鸿雁，顾大磊，葛婷婷

临床来源副溶血弧菌毒力基因及耐药性分析

周方满，谢红意，叶鸿雁，顾大磊，葛婷婷

目的了解急性腹泻患者中副溶血弧菌的分布、毒力基因及耐药性。方法对急性腹泻病例的粪便标本进行致病菌分离培养，采用聚合酶链反应（PCR）方法开展tlh、tdh和trh毒力基因检测，采用VITEK2 Compact细菌分析系统对副溶血弧菌分离株进行药敏试验。结果从2 307例腹泻病患者粪便标本中检出副溶血弧菌180株，分离率为7.8%。副溶血弧菌感染主要发生在7—10月份，其中8月份最多。毒力基因检测发现171株tdh阳性，占95.0%；4株trh阳性。副溶血弧菌对氨苄西林、头孢唑啉、头孢西叮的耐药率分别为96.7%、88.9%、23.3%，对其他实验药物敏感，未发现多重耐药菌株。结论副溶血弧菌感染在本地区夏秋季急性腹泻中占有重要地位，对青霉素类、第一代和第二代头孢药物的耐药率较高，tdh是副溶血弧菌最主要的毒力基因。

副溶血弧菌；毒力；耐药性

1　资料与方法

1.1标本来源与鉴定收集宁波市北仑区人民医院2014年4月至2015年10月急性腹泻患者2307例，符合年龄1～80岁，每天排便≥3次，且大便性状有改变（呈稀便、水样便、黏脓便或脓血便等），病程≤14 d的腹泻患者。标本采集后直接接种于碱性蛋白胨水进行增菌，18～24 h后接种至TCBS平板，VP的分离培养与鉴定按《全国临床检验操作规程》（第三版）［2］进行。所需生化培养基和生化试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司，采用法国生物梅里埃VITEK2 Compact细菌分析系统进行细菌鉴定。1.2毒力基因检测将分离鉴定的VP菌株，接种血平板，经37℃过夜培养，挑取3～5个火柴头大小菌量悬浮于灭菌蒸馏水，煮沸10 min，然后13 000 r/min离心10 min，留取上清（含VPDNA模板）。毒力基因tdh、tlh和trh的引物序列参考文献［3］（由上海生工生物工程有限公司完成）。引物序列、扩增产物及反应条件见表1。

1.3药敏试验采用VITEK2Compact细菌分析系统对分离的VP进行体外药物敏感性试验。质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922、铜 绿 假 单 胞菌ATCC27853 和金黄色葡萄球菌ATCC25923。

2　结果

2.1分布情况共分离出 VP 180株，分离率为7.8%。180例VP阳性的腹泻患者男102例，女78例；年龄10个月至80岁；7—9月份检出率最高，共分离出125株VP，占69.4%。

2.2毒力基因检测所有VP tlh基因均阳性；171株tdh基因阳性，占95.0%；4株为trh阳性。

2.3药物敏感性试验VP对氨苄西林、头孢唑啉的耐药率较高，分别为96.7%、88.9%；对头孢西叮耐药率23.3%，中度敏感率23.3%；对其他实验药物敏感，未发现多重耐药菌株，见表2。

表1　毒力基因引物及反应条件

表2　180株副溶血弧菌药物敏感性试验结果　%

3　讨论

在我国由VP引起感染事件呈上升趋势。本文从宁波市北仑区2 307例急性腹泻患者中分离VP 180株，分离率高达7.8%，高于陈海丽等［4］报告结果，可能与本地居民生食海鲜习惯有关。金培婕等［5］报告浙江沿海地区海产品及环境中VP检出率达70%，因此改变生食海鲜习惯，加强饮食卫生十分重要。

目前认为VP的致病性与其携带tdh 和trh基因产生的毒素有关［6］，本文应用聚合酶链反应（PCR）方法检测发现，180 株VP tdh、trh基因携带率分别是95.0% 和2.2%与文献［7-8］研究结果基本一致。

本文药物敏感性试验显示，急性腹泻患者VP对青霉素类药物（如氨苄西林）、第一代和第二代头孢药物（如头孢唑啉、头孢西叮）的耐药率较高，分别为96.7%、88.9%、23.3%。对喹诺酮类、复合青霉素类、碳氢酶烯类、复方新诺明、第三代和第四代头孢等药物敏感性较好，未发现多重耐药菌株，与国内报道基本一致［9-10］。喹诺酮类药物如环丙沙星、左氧氟沙星的药物敏感性较好且价格低廉拟推荐作为治疗VP感染首选药物。

本文VP系临床分离菌株，对复方新诺明敏感，未发现多重耐药菌株，与吴蓓蓓等［11］报告本地区海产品及环境分离株差异很大，究其原因可能与其采样的海产品养殖场的使用抗生素有关，能否椐此说明自然生态环境中VP的耐药性差异有待于进一步研究分析，但是笔者认为禁止或限制农业生产中滥用抗生素刻不容缓。

［1］WangS，DuanH，ZhangW，etal.Analysis of bacterial foodborne disease outbreaks inChinabetween1994and2005［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2007，51：8-13.

［2］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.南京：东南大学出版社，2006：822-825.

［3］Bej AK，Patterson DP，Brasher CW，et al. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl，tdh and trh［J］.J Microbiol Methods，1999，36（3）：215-225.

［4］陈海丽，周海健，宰淑蓓，等.2010-2012年上海市两家哨点医院门诊腹泻病例副溶血弧菌感染状况及菌株分子特征分析［J］.中华预防医学杂志，2015，49（3）：233-236.

［5］金培婕，吴蓓蓓，王淑娜，等.浙江沿海地区海产品及环境中副溶血弧菌的分离与主要毒力基因分析［J］.微生物学通报，2009，36（7）：962-967.

［6］Nishibuchi M，Kaper JB.Duplicationand variation of the thermostable direct haemolysin（tdh）gene in Vibrioparahemolyticus［J］.Mol Microbiol，1990，4（1）：87-89.

［7］Shirai H，ho H，Hirayama T，et a1.Molecular epidemiologicevidence for association of thermostable direct hemolysin （TDH）and TDH-related hemolysin of V/ brio parahaemofwicus withgastroenterifis ［J］.Infect Immu，1990，58：3568-3573.

［8］范艳艳，朱敏，尚欣荣，等.副溶血弧菌临床分离株毒力特征与多位点序列分型研究［J］.中华检验医学杂志，2013，36（6）：548-552.

［9］韩东升，陈晓，李中杰，等.浙江省急性腹泻副溶血弧菌的流行及多位点序列分型分析［J］.环境与健康杂志，2012，29（10）：917-919.

［10］孙宇峰，范艳艳，黄艳飞，等.临床分离副溶血弧菌药敏表型和毒力特征分析［J］.中华医学杂志，2013，93（34）：2733-2735.

［11］吴蓓蓓，俞盈，金培婕，等.宁波地区海产品和环境中副溶血弧菌主要毒力和耐药性［J］.中国人兽共患病学报，2011，27（5）：381-385.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.056

R446.6

A

1671-0800（2016）07-0949-02副溶血弧菌（VP）是一种嗜盐性革兰阴性病原菌，通过食源性途径引起的中毒事件已经超过沙门菌和志贺菌，可引起食物中毒和腹泻，成为我国首要的食源性致病菌［1］。北仑的海产品食用比较盛行，是VP感染的高发区。本文收集北仑区腹泻患者的粪便标本，通过对VP的毒力基因和耐药性型分析，了解本地区VP的毒力和耐药性，以指导临床治疗，报道如下。

宁波市医学科技计划项目（2014A41）

315800宁波，宁波市北仑区人民医院

谢红意，Email：xiehongyi 2000@126.com

2016-02-05（本文编辑：孙海儿）