CAV1脚手架样结构域多肽抑制HEp2细胞生长的实验研究

顾栋桦，付琳琳，平金良

CAV1脚手架样结构域多肽抑制HEp2细胞生长的实验研究

顾栋桦，付琳琳，平金良

目的研究CAV1脚手架样结构域（CSD）多肽对喉鳞癌细胞株HEp2细胞生长的影响及其机制。方法CSD多肽和乱序多肽由人工合成得到，并在N'末端用生物素标记，用免疫细胞化学法检测CSD多肽在HEp2细胞中的内化情况，细胞生长能力用MTT法检测；流式细胞仪检测HEp2细胞的细胞周期及细胞凋亡；免疫印迹法检测HEp2细胞中Erk1/2蛋白的表达及磷酸化程度。结果免疫细胞化学检测显示CSD多肽能够较好的进入HEp2细胞内；用CSD多肽处理细胞能够明显抑制肿瘤细胞的生长，使更多的细胞处于G0/G1细胞静止期，并能够增加HEp2细胞的凋亡率；CSD多肽不影响HEp2细胞中Erk1/2蛋白的表达，但能明显减少Erk1/2蛋白的磷酸化水平。结论CSD多肽能够抑制HEp2细胞的生长，并且促进其细胞凋亡；Erk1/2蛋白的磷酸化水平下降可能是其重要的分子机制。

Caveilin-1；细胞生长；多肽；鳞状细胞癌

Caveolin-1（CAV1）是一种细胞膜蛋白，是构成细胞膜上一种小凹结构的关键成分。目前研究发现CAV1在细胞膜上的信号转导蛋白活性调节中发挥重要作用，并参与调控细胞的生物学行为。CAV1蛋白具有一个脚手架样结构域（CSD），依赖这个结构可以和许多信号转导相关蛋白结合，抑制蛋白的酪氨酸激酶活性［1］。本研究用体外细胞实验来研究人工合成的CSD多肽对喉鳞癌细胞株 HEp2细胞生长的影响，并探讨CSD多肽做为抗肿瘤药物的可行性。现报道如下。

1　资料与方法

1.1材料与试剂CSD多肽序列由上海翱博生物科技有限公司合成，氨基酸序列为DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，N端连接生物素标记，另外以同样的氨基酸构成乱序排列的乱序多肽WFADGI SKT VRKYWFTFT YT做为阴性对照。多肽用细胞培养液DMEM （Sigma公司，美国）稀释溶解至终浓度4.0 M后处理培养细胞。碱性磷酸酶标记的抗生物素（Biotin）小鼠单克隆抗体（工作浓度1：300）购于美国Jackson Im-

1.2方法

1.2.1免疫细胞化学法检测多肽的细胞渗透能力细胞培养6孔板中放置24 mm×24 mm盖玻片，把处于生长对数期的HEp2细胞接种于6孔板中，当细胞贴壁生长至盖玻片上，细胞密度为70%时，加入CSD多肽，孵育6h后取出盖玻片，用冷丙酮固定10 min，用碱性磷酸酶标记的抗生物素（Biotin）小鼠单克隆抗体37℃孵育2 h，PBS冲洗后加入NBT/BCIP显色。

1.2.2流式细胞仪检测细胞生长至50%汇合时，加入多肽处理6 h后，用胰酶消化细胞制成细胞悬液，用冷柠檬酸缓冲液固定30 min，溴化丙啶染色后流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，增殖指数（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。实验组分为CSD多肽组、乱序肽组及未处理组，实验重复3次。

1.2.3MTT法检测细胞体外生长细胞消化后，按1 000个/孔密度接种于96孔板中，分为CSD多肽组、乱序肽组及未处理组。在培养的1、2、3、4、5、6、7 d加入MTT 20l/孔，继续闭光培养4 h，弃上清加入150 l/孔二甲基亚砜溶解结晶，在酶联免疫检测仪（Molecular Devices公司）上读取吸光值（A），测定波长490 nm。空白对照孔设为不含细胞的完全培液。每组设4孔，结果取均值，实验重复3次。以时间为横轴，A490为纵轴做细胞生长曲线图。

1.2.4免疫印迹法检测细胞呈生长对数期时，用多肽处理，分组同前，处理48h后收集细胞，裂解细胞提取总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）变性电泳，然后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入相应的一抗，4℃孵育过夜，用PBS洗涤后，加入过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，最后用ECL法试剂盒按产品说明书步骤显色。条带用 Pro Analyzer4.0软件进行积分吸光度（IA）分析，以 -actin作为内参。所有实验重复3次。

1.3统计方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，CSD多肽组、乱序肽组与未处理组数据分析采用检验。＜0.05为差异有统计学意义。

表1　流式细胞仪检测细胞周期及凋亡

2　结果

2.1CSD多肽在 HEp2细胞内渗透能力用CSD多肽处理HEp2细胞6 h后，用免疫细胞学检测生物素标记的 SCD多肽，经NBT/BCIP显色，显微镜下可发现HEp2细胞胞质中内出现蓝紫色颗粒（图1）。

2.2CSD多肽对 HEp2细胞生长的影响用多肽处理HEp2细胞后，用MTT法生成的生长曲线来看（图2），未处理组和乱序多肽组的HEp2细胞在第5天开始进入生长平台期；而用CSD多肽处理的HEp2细胞生长明显减慢，从第2天开始其A490值（0.79±0.13）比未处理组（1.67±0.43）明显降低，差异有统计学意义（=3.38，＜0.05），乱序肽组和未处理组差异无统计学意义（=0.34，＞0.05）。

2.3CSD多肽对 HEp2细胞的细胞周期和凋亡的影响与未处理组相比，CSD多肽组更多的细胞处于生长静止期（G0/G1期）（=5.02，＜0.05），而且S期和G2/M期的细胞比例低于未处理组（=4.06、4.28，均＜0.05），乱序肽组和未处理组差异均无统计学意义（均＞0.05）。CSD多肽组的细胞凋亡率明显高于未处理组（=4.93，＜0.05），而未处理组和乱序肽组差异无统计学意义（=0.17，＞0.05）。见表1。

2.4CSD多肽对HEp2细胞Erk1/2蛋白磷酸化的影响用多肽处理24h后，CSD多肽组磷酸化ERK1/2蛋白明显低于未处理组，用 -actin作为内参校正后，CSD多肽组磷酸化ERK1/2蛋白相对表达量为未处理组的61.29%，差异有统计学意义（=2.94，＜0.05）；未处理组和乱序肽组差异无统计学意义（=0.42，＞0.05）。见图3。

3　讨论

CAV1是 caveolae的主要功能蛋白，其基因位于7号染色体q31.1，这个区域是许多肿瘤容易发生丢失的脆性位点，形成的蛋白大小为21～24 kD，其N端第14位氨基酸残基具有酪氨酸磷酸化位点，C端具有棕榈酰化位点，第82 ～101氨基酸序列为CAV1的重要功能区域，具有CSD，依赖这个结构可以和许多信号转导相关蛋白（如EGFR、G蛋白等）结合，抑制其酪氨酸激酶活性，并调节其下游信号转导通路［1］。

近年来的研究结果表明许多肿瘤中存在着 CAV1基因表达及功能的异常，虽然CAV1在不同肿瘤中的作用报道不一，但在一部分肿瘤中，CAV1表现出抑制肿瘤的作用，例如很多肿瘤细胞株的CAV1表达处于低水平状态［2］，增加CAV1基因的表达水平可以抑制肿瘤细胞的生长和转移、促进肿瘤细胞的凋亡［3-4］。而且一些肿瘤中，如乳腺癌［5］、肝癌［6］及腺泡状横纹肌肉瘤［7］等肿瘤组织中，CAV1表达水平明显减少，并且CAV1低表达的患者预后更差。Jung等［8］的研究中，CAV1阴性的头颈部鳞癌更易发生上皮-间质转化，更容易发生转移，并且预后不良。笔者前期的研究发现HEp2细胞高表达CAV1基因后，肿瘤细胞的生长能力能明显被抑制［9］，说明CAV1在喉鳞癌细胞中可能起着抑癌基因的作用。

图1　免疫细胞化学法检测（NBT/BCIP显色，×400）

图2　细胞生长曲线

图3　免疫印记法检测蛋白表达水平

CAV1蛋白的脚手架结构是它发挥生物学功能的重要结构，Tahir等［10］用CSD肽处理前列腺癌细胞，能够有效地减少肿瘤新生血管的生成、抑制肿瘤的生长。本研究结果表明，用合成的CSD多肽能够顺利渗入HEp2细胞内。用CSD多肽处理HEp2细胞，能明显抑制细胞的生长，更多的细胞处于生长静止期，并且细胞凋亡率也明显上升。结果说明利用CAV1的CSD氨基酸序列体外合成的多肽能够发挥其生物学效应，并且抑制HEp2细胞的生长，并促进凋亡。

细胞的生长受许多信号转导通路的调节，胞外信号调节激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员，是调节细胞生长和发育信号网络的重要环节［11］，目前研究表明CAV1能够与上皮生长因子受体（EGFR）结合，并能够抑制期下游Erk1/2蛋白的磷酸化程度［1］。本研究结果显示用CSD多肽处理HEp2细胞后，细胞 Erk1/2蛋白的磷酸化水平明显下降，提示CSD多肽抑制HEp2细胞生长可能与降低 Erk1/2蛋白磷酸化水平以及相关的生长信号通路被抑制有关。

综上所述，体外合成的CSD多肽能够有效进入HEp2细胞内，并且能够抑制HEp2细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，CSD多肽还能抑制Erk1/2蛋白的磷酸化水平，其抑制细胞生长能力可能和 Erk1/2蛋白相关的生长信号通路被抑制有关，CSD多肽的抑制肿瘤的功能及具体的分子机制还有待深入研究。

［1］Sohn J，Brick RM，TuanRS.Fromembryonic development to human diseases：The functional role of caveolae/caveolin［J］.BirthDefectsResCEmbryoToday，2016，108 （1）：45-64.

［2］LamazeC，TorrinoS.Caveolaeandcancer： Anewmechanical perspective［J］.Biomed J，2015，38（5）：367-379.

［3］ZhangK，YangG，Wu W，et al.Decreased Expression of Caveolin-1 and E-Cadherin Correlates with the Clinicopathologic Features of Gastric Cancer and the EMT Pro cess［J］.RecentPatAnticancerDrugDiscov，2016，11（2）：236-244.

［4］Quann K，Gonzales DM，Mercier I，et al. Caveolin-1 is a negative regulator of tumor growth in glioblastoma and modulates chemosensitivity to temozolomide［J］.Cell Cycle，2013，12（10）：1510-1520.

［5］黄杰，廖湘晖，彭丽娇.窖蛋白-1和埃兹蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系［J］.中华实验外科杂志，2013，30（6）：1281-1282.

［6］王冰，王欣，徐明丽.窖蛋白-1和RhoE在肝癌癌变过程中表达及其临床意义 ［J］.中华实验外科杂志，2014，31（8）：1805-1807.

［7］Juan HM，Santiago RV，David HM，et al. Caveolin-1 is down-regulated in alveolar rhabdomyosarcomas and negatively regulates tumor growth［J］.Oncotarget，2014，5（20）：9744-9755.

［8］JungAC，Ray AM，Ramolu L，et al.Caveolin-1-negative head and neck squamous cell carcinoma primary tumors display increasedepithelialtomesenchymaltransition andprometastatic properties［J］.Oncotarget，2015，6（39）：41884-41901.

［9］顾栋桦，唐峰，王震，等.caveolin-1对喉鳞状细胞癌生物学特性的影响［J］.中华肿瘤杂志，2007，29（5）：329-333.

［10］TahirSA，ParkS，ThompsonTC.Caveolin-1 regulates VEGF-stimulated angiogenic ac tivitiesinprostatecancerandendothelialcells ［J］.CancerBiolTher，2009，8（23）：2286-2296. ［11］Kim EK，Choi EJ.Compromised MAPK signaling in humandiseases：an update［J］. Arch Toxicol，2015，89（6）：867-882.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.049

R739.6；R392

A

1671-0800（2016）07-0937-03

湖州市科技计划项目（2012YSB19、2013GYB11）

313000浙江省湖州，湖州市中心医院

顾栋桦，Email：donghuagu @sohu.communoResearch公司，兔抗人Erk1/2多克隆抗体（工作浓度1：1 000）、兔抗人磷酸化Erk1/2多克隆抗体（工作浓度1：1000）购自美国cell signaling公司，鼠抗人 -actin单克隆抗体（工作浓度1：1000）购自美国Sigma公司，过氧化物酶标记的二抗（工作浓度1：2 000）购于上海鼎国公司，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（NBT/BCIP）购于瑞士Roche公司，ECL法试剂盒购于美国Pierce公司。细胞株及培养条件：人喉鳞癌细胞HEp2细胞购于美国ATCC公司，细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下用含10%胎牛血清（hyclone公司，美国）的无菌DMEM培养基培养，细胞生长至70%～80%细胞密度时传代。

2016-03-22（本文编辑：陈志翔）