V EGF-165/A N G-1双基因共转染血管内皮祖细胞复合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究*

冯永增，王成贵，水小龙，余洋，蔡乐益，徐华梓

（温州医科大学附属第二医院 创伤骨科，浙江 温州 325000）

论著

V EGF-165/A N G-1双基因共转染血管内皮祖细胞复合多孔生物活性玻璃的生物相容性研究*

冯永增，王成贵，水小龙，余洋，蔡乐益，徐华梓

（温州医科大学附属第二医院 创伤骨科，浙江 温州 325000）

目的制备一种具有诱导血管再生活性的新型复合骨组织工程材料，并评价其生物相容性。方法将血管内皮生长因子-165（V E G F-165）/血管生成素-1（AN G-1）双基因共转染的血管内皮祖细胞（E P C s）复合多孔生物活性玻璃，制成复合人工骨材料。采用W e s t e r n blot、逆转录-聚合酶链反应（R T-P C R）检测已转染E P C s中V E G F-165及AN G-1的表达。噻唑蓝（M TT）细胞毒性试验、骨植入试验及扫描电镜观察细胞在材料表面黏附情况等综合评价材料的生物相容性；C D31免疫组织化学法染色观察材料中血管再生的情况。结果W e s t e r n blot检测、R T-P C R反应显示，实验组V E G F-165、AN G-1的表达较对照组升高。M TT细胞毒性试验、骨植入试验均显示，材料无毒性反应。扫描电镜显示，材料表面有较多血管内皮祖细胞黏附，并有较多伪足伸出。苏木精-伊红染色法（H E）染色显示，材料周围组织生长良好，未见明显的炎症细胞浸润，材料与周围组织交界处有大量的新骨生成。C D31免疫组织化学法染色显示，材料中有较多新生的毛细血管。结论V E G F-165/AN G-1双基因共转染E P C s复合多孔生物活性玻璃的骨组织工程材料生物相容性良好，具备一定的诱导血管再生活性。

血管内皮生长因子-165/血管生成素-1双基因；生物活性玻璃；骨材料；生物相容性；血管再生

由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是临床上遇到的常见问题。研制出理想的骨修复材料一直是生物材料学和临床医学努力探索的一个方向。生物活性玻璃作为一种新型的人工骨材料，因其具有良好的成骨诱导活性而被广泛用于临床治疗和实验研究，但血管化能力差，限制其在骨缺损修复中的推广应用［1］。转基因工程技术的发展为解决这一难题提供新的思路和方法［2］。血管内皮细胞生长因子（v asc u lar endothelial g ro w th f actor，V E G F）是体内促进血管新生的最重要因子，而V E G F-165在V E G F家族中活性最强，分布范围广，是体内发挥作用的主要形式。但V E G F诱导的新生血管结构不完整，渗漏性强，易形成水肿，不成熟，血管多数难以发挥正常功能［3］。血管生成素-1（A n g iopoietin-1，A N G-1）能够完成血管的精细结构，促使血管成熟，有效防止炎症及V E G F所致的血管通透性增加，减少渗出水肿等副反应［4］。P ETE RS等［5］研究认为，联合应用V E G F与A N G-1具有协同作用，不但可以促进血管生成，而且会使新生血管结构更成熟稳定，功能更健全，促进缺血心肌、肢体的血管再形成。

本研究将V E G F-165与A N G-1双基因共转染的血管内皮祖细胞（endothelial pro g enitor cells，E PC s）种植于多孔生物活性玻璃内，以期制备一种具有诱导血管再生活性的骨组织工程材料，并通过细胞水平和动物水平综合评价其生物相容性。

1　材料与方法

1.1实验试剂、材料及动物

4月龄新西兰大耳兔14只，体重3.0～3.5 k g，雌雄不限（4只用于分离提取血管内皮祖细胞，10只用于骨植入实验）。

胎牛血清、磷酸缓冲盐溶液、改良达尔伯克必需基本培养基（d u lbecco's minim u m essential medi u m，D M E M）（美国G ibco公司），胰酶（美国G ibco公司），青链双抗（北京L ea g ene公司），Tri z ol（美国I n v itrog en公司），逆转录试剂盒（日本Ta K a R a公司），V E G F-165、A N G-1抗体（英国A bcam公司），C D31（美国R D S ystems公司），噻唑蓝［3-（4，5-dimethyl-2-thia z olyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra z oli u m bromide，M TT］试剂盒（上海碧云天生物技术研究所），A d. V E G F-165和A d.A N G-1腺病毒载体（北京诺赛公司）。

1.2实验方法

1.2.1材料的制备及其结构特点使用磷酸三乙酯（triethyl phosphate，TE P）作为P2O5的前驱体，正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TE O S）作为S i O2的前驱体，硝酸盐C a（N O3）2·4H2O，M g（N O3）2·6H2O作为碱金属和碱土金属氧化物的前驱体。TE O S和TE P在酸或碱的催化作用下在水溶液中进行水解形成溶胶，然后加入C a（N O3）2·4H2O，M g（N O3）2·6H2O等均匀混合，陈化后得到凝胶，经过干燥和煅烧后得到玻璃。最后切成5mm厚度的片状，环氧乙烷消毒。扫描电子显微镜观察复合材料的表面微观结构。

1.2.2血管内皮祖细胞的培养本研究所采用的细胞为兔血管内皮祖细胞，其原代培养及鉴定参照相关文献［6-7］，细胞密度＞80%后进行传代，每3 d换液1次。分别于第3和5天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

1.2.3双基因腺病毒载体的构建及对兔E P C s的转染构建腺病毒载体 A d.V E G F-165和 A d. A N G-1，取培养的第3代血管内皮祖细胞，胰酶消化后，以1×105个细胞/孔接种于6孔板，置于5%二氧化碳C O2浓度，37℃的细胞培养箱中。于对数生长期时，以感染复数为100进行体外转染E PC s。并将E PC s分为4组：V E G F-165及A N G-1双基因共转染组、V E G F-165单基因转染组、A N G-1单基因转染组、无转染E PC s组。通过W estern blot检测、逆转录-聚合酶链反应（re v erse transcription-polymerasechainreaction，R T-PC R） 等 方 法 检 测V E G F-165及A N G-1蛋白在细胞内的表达和分泌。

1.2.4M TT细胞毒性试验将制备好的片状材料浸没于含10%胎牛血清、1%青链双抗的D M E M培养基中，固液比例为0.2 g/ml，37℃浸提48 h，浸提液经0.22μm过滤器过滤后置于4℃冰箱冷冻保存备用。将上述4组E PC s分别接种于25mm2细胞培养瓶中，置于37℃、5%C O2细胞培养箱中。于对数生长期时，用2.5%胰蛋白酶消化1～2min，轻轻吹打制成细胞悬液。按2 000细胞/孔的密度接种于96孔板上，置于37℃细胞培养箱中培养4 h后，待细胞贴壁后去除原先的培养基，各组分别加入上述预先制备好的材料培养基浸提液。于接种后的第1、3和5天分别取出各一块96孔板，每孔加入10μl M TT试剂，4 h后用酶标仪测波长570nm处的光密度。

1.2.5扫描电镜将V E G F-165/A N G-1双基因共转染的E PC s，在其对数生长期时，用2.5%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，接种于已制备好的多孔生物活性玻璃，并加入细胞培养基，37℃，5%C O2细胞培养箱中培养72 h。取出骨材料，2.5%戊二醛固定，酒精及叔丁醇梯度脱水，离子溅射喷金，于扫描电镜下观察材料表面细胞的形态变化和生长状况。

1.2.6骨植入试验取20只健康新西兰大耳白兔，随机分成实验组和对照组，每组10只。用10%水合氯醛（3m l/k g）腹腔麻醉后，于右侧膝关节外侧备皮，碘伏消毒后，暴露股骨外侧髁，保护神经和血管。剥离骨膜后于外侧髁上以直径5mm的钻头钻孔，钻入长度为10mm。实验组植入转染双基因E PC s的复合材料，对照组植入无复合任何种子细胞的材料。然后逐层缝合切口。术后80万u青霉素抗感染3 d。各组分别于术后4和8周将5只兔子安乐死，取材做病理切片，苏木精-伊红（hemato x ylin-eosin，H E）染色法观察新骨生长及材料周边的炎症情况。C D31免疫组织化学法染色观察材料中血管再生的情况。

1.3统计学方法

采用S P SS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较用方差分析，若方差齐则两两之间的多重比较用LS D-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1多孔生物活性玻璃的表面微观结构

制得的S i O2-C a O-M g O-P2O5多孔生物活性玻璃孔隙率在70%左右，而且孔径大小为100～300μm，孔隙之间的连通性良好，具备种子细胞生长的良好条件。见图1。

2.2细胞形态及生长状况

培养的第3天可见细胞基本贴壁并开始进入增殖分裂。第5天细胞数量明显增多，基本长满培养瓶，可见细胞增殖旺盛，生长状况良好。见图2。

2.3Wester n blot检测

实验组与对照组比较，V E G F-165及A N G-1双基因共转染组血管内皮祖细胞中A N G-1、V E G F-165的表达量均高于对照组。见图3。

2.4RT-PCR反应

图1　电镜观察制备的S i O2-CaO-M g O-P2O5多孔结构骨材料

图2　细胞的生长状况 （×200）

图3　血管内皮祖细胞中A N G-1、V EGF-165翻译水平的相对表达量

各组血管内皮祖细胞中V E G F-165和A N G-1的表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F= 9.419和28.413，P=0.003和0.000）。V E G F-165及A N G-1双基因共转染组血管内皮祖细胞中V E G F-165和A N G-1的表达量与对照组比较，经t检验，差异有统计学意义（t=-1.260和-1.960，P=0.001和0.000），V E G F-165及A N G-1双基因共转染组血管内皮祖细胞中V E G F-165和A N G-1的表达量较对照组增高。见图4。

2.5MTT细胞毒性试验

细胞接种后第1、3和5天进行M TT检测，采用重复测量数据的方差分析结果：①不同时间点测得的光密度值比较差异有统计学意义（F=59.420，P= 0.004），各组光密度值均随着时间的延长而升高；②不同组别间的光密度值比较，差异无统计学意义（F=9.358，P=0.098），表明各组细胞增殖能力一致。见附表和图5。

2.6扫描电镜

图4　血管内皮祖细胞中V EGF-165、A N G-1转录水平的相对表达量

扫描电镜可见血管内皮祖细胞黏附在材料表面，形态饱满，呈梭形，有较多的伪足伸出并相互连接融合。种植后第8与第4天扫描电镜结果比较，可见血管内皮祖细胞显著增多，表明细胞与复合材料的生物相容性良好。见图6。

2.7骨植入试验

图5　各组细胞第1、3和5天MTT检测结果的变化趋势

图6　材料表面种植细胞后第4和8天扫描电镜结果

附表　各组细胞第1、3和5天光密度值比较 （）

附表　各组细胞第1、3和5天光密度值比较 （）

图7　术后4和8周骨切片H E染色结果 （×100）

病理切片H E染色显示，实验组和对照组材料周围组织及交界部位生长状态良好，未见明显的炎症细胞浸润，材料外层已经开始降解；实验组有较多的新生骨质（见图7）。C D31免疫组织化学法染色显示，实验组材料中有较多新生的毛细血管（见图8）。

图8　术后4和8周CD31免疫组织化学法染色结果 （×100）

3　讨论

由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是临床上遇到的常见问题。目前自体骨移植仍然是治疗骨缺损的金标准［8］。但自体骨存在供骨量少，不能满足大面积植骨的需求，且供区易出现损伤、感染、疼痛等并发症［9］。因此，研制出理想的人工骨修复材料已成为临床医学和生物材料学努力探索的一项热门课题。单一成分的组织工程骨修复小段骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果良好，但在用于修复大段骨缺损时，其材料内部往往容易出现缺血性坏死，导致修复失败，其主要原因就在于没有很好地解决组织工程骨的血管化问题，血管化问题现已成为制约组织工程骨应用于临床的瓶颈［10］。

E PC s是一群尚未表达成熟血管内皮细胞表型，具有游走性，能分化为血管内皮细胞，参与血管形成，并能在出生后的血管新生过程中促进血管生成［11-12］。这一发现也为解决组织工程骨血管化问题提供新的思路［13］。但是由于E PC s的细胞数量少，获取难度大，体外培养周期长，培养时需要扩增等缺点，限制其在临床研究及动物实验中的应用。近年来，随着基因工程技术的飞速发展，转基因的组织工程技术为血管化提供新的思路和方法。S H E等［14］报道，应用V E G F-165基因转染的E PC s能明显促进缺血心肌中血管新生，从而明显改善大鼠急性心肌梗死后的心功能。S H EN等［15］研究表明，单纯应用V E G F或A N G-1基因转染，仅能使脑缺血体积分别减少36% 和33%，假如两者协同转染，可使脑缺血体积减少44%。因此，学者们可以通过将V E G F-165与A N G-1双基因共转染E PC s，弥补其数量不足的缺点，增强E PC s的新生血管特性，能大大优化E PC s的促血管新生效果。

目前，生物活性玻璃支架材料的研究与应用已经成为生物医学材料学科的研究热点［16］。Z HOU［17］和S A NT O CI L DE S-R O M E R O等［18］实验研究证实，生物活性玻璃能够在早期诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和基质矿化，说明其具有一定的骨诱导性，但其血管化能力差限制其在节段性骨缺损中的应用［1］。因此，笔者将转染双基因的E PC s种植于多孔生物活性玻璃内，以期构建兼具骨诱导及血管生成诱导活性的组织工程骨材料，并对其生物相容性进行研究。

组织工程骨作为一种植入人体的医用材料，必须具有良好的生物相容性和生物安全性［19］。根据我国卫生部门的相关标准，对于长期植入人体的材料必须进行生物安全性评价［20］。因此，本实验从细胞水平和动物水平两方面，观察复合组织工程骨的生物相容性。从细胞水平来看，M TT细胞毒性实验、扫描电镜的结果表明，所制备的材料对转染的E PC s无毒性，细胞在材料表面增殖明显。从动物水平来看，病理切片H E染色及C D31免疫组织化学法染色可见组织工程骨周围与其交界处有较多的新生骨质，植入的材料周围组织生长良好，未见明显的炎症细胞浸润，同时材料中已长入较多的新生毛细血管，表明复合材料的生物相容性良好，具备一定的诱导血管生成活性和促进骨缺损修复的作用。

综上所述，V E G F-165/A N G-1双基因共转染E PC s复合多孔生物活性玻璃人工骨材料具有良好的生物相容性，并具备一定促进血管生成和骨缺损修复的作用。但是，该复合材料在修复节段性骨缺损的作用如何，材料的具体降解速率及新生血管的定量分析都将有待下一步的动物实验及临床应用检验。

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（童颖丹 编辑）

Biocom patibility of porous bioactive glass-ceram ic loaded w ith VEGF165 and ANG1 gene cotransfected EPCs*

Yong-zeng Feng，Cheng-gui Wang，Xiao-long Shui，Yang Yu，Le-yi Cai，Hua-zi Xu
（Department of Orthopaedics，the Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou，Zhejiang 325000，China）

Objective To prepare a novel bone tissue engineering material with angiogenesis activity，and evaluate the biocompatibility and safety of the composites.M ethods Endothelial progenitor cells（EPCs）were cotransfected with VEGF165 and ANG1 genes and loaded into porous bioactive glass-ceramic to make the composite.The expressions of VEGF165 and ANG1 in EPCs were detected by RT-PCR and Western blot. MTT cytotoxicity test，bone implantation test and electron microscopic examination were used to comprehensively evaluate the biocompatibility of the composite.Immunohistochemical staining of CD31 was used to analyze revascularization of the composite zones.Results Both RT-PCR and Western blot showed cotransfected EPCs expressed increased VEGF165 and ANG1.The results of MTT cytotoxicity test and bone implantation test showed that the material was non-toxic.Scanning electron microscope displayed many EPCs adhered to the surface of the material，and had a lot of pseudopods.HE staining revealed tissue surrounding the material grew well without marked inflammatory cell infiltration.CD31 immunohistochemical staining indicated newly-formed capillaries into the material，demonstrating that the new tissue engineering material has good biocompatibility.Conclusions The composite of porous bioactive glass-ceramic loaded with VEGF165 and ANG1 gene cotransfected EPCs has good biocompatibility，and can improve angiogenesis.

VEGF165；ANG1；bioactive glass-ceramic；bone tissue engineering material；biocompatibility；angiogenesis

R318.08

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.008

1005-8982（2016）15-0044-06

2015-12-28

浙江省医药卫生科技计划项目（No：2016KY A138）；浙江省温州市公益性科技计划项目（No：Y20140569）