法舒地尔对百草枯中毒大鼠肺组织肺纤维化?-SMA的影响

何旭娟，徐丽艳，朱立军，韩文文

法舒地尔对百草枯中毒大鼠肺组织肺纤维化?-SMA的影响

何旭娟，徐丽艳，朱立军，韩文文

目的观察法舒地尔在急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺组织的干预作用及对 -平滑肌肌动蛋白（ -SMA）表达的影响。方法将72只SPF级SD大鼠随机分成正常对照组、法舒地尔对照组、PQ中毒组及法舒地尔干预组，分别于灌胃后7、14、28d活杀大鼠留取标本。观察大鼠的行为学改变、HE和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变，实时荧光定量PCR及免疫组化法检测 -SMA的表达水平。结果光镜下，PQ中毒组大鼠急性肺损伤和纤维化明显，法舒地尔干预组大鼠肺组织损伤程度较中毒组减轻。与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28 d-SMAmRNA及蛋白的表达量显著增高，于28 d时达峰值，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与同一时间PQ中毒组比较，法舒地尔干预组小鼠肺组织 -SMAmRNA及蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论法舒地尔可以减轻百草枯所致大鼠肺纤维化程度，其可能是抑制 -SMA的表达实现的。

肺纤维化；-SMA；百草枯；法舒地尔

1　资料与方法

1.1实验动物SPF级健康雄性SD大鼠72只，200～230 g，10周龄左右，杭州动物实验中心提供，动物合格证号为

SCXK（浙）2014-0001。

1.2实验材料注射用法舒地尔（红日药业股份有限公司，中国天津）；20%PQ溶液（天海科技有限公司，山东济南）；-SMA抗体、免疫组化试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）。

1.3方法将72只SPF级SD大鼠随机分为4组，即正常对照组、法舒地尔对照组、PQ中毒组及法舒地尔干预组。各组再按随机原则分为7、14、28 d 3个亚组，每亚组6只大鼠。PQ中毒组与法舒地尔干预组大鼠予百草枯50 mg/kg，一次性灌胃染毒，两对照组予等量0.9%氯化钠注射液1次性灌胃，法舒地尔对照组与法舒地尔干预组于PQ染毒后予法舒地尔注射液30 mg·kg—1·d—1腹腔注射1次，染毒组及对照组给予等量0.9%氯化钠注射液每天腹腔注射1次。观察并记录各组大鼠的体质量及行为学改变。各组大鼠于灌胃后第7、14、28天分批处死。开胸完整取出肺组织并观察整体肺的变化情况，左上肺置于4%甲醛中固定，制备石蜡切片供组织学检查，HE染色、Masson染色及免疫组化，其余肺组织入—70℃低温冰箱保存，待测时制备肺组织匀浆。

1.4检测指标

1.4.1大鼠肺组织病理观察大鼠肺组织经4%甲醛固定后，脱水、包埋、连续切片，进行HE、Masson染色，光学镜下观察肺组织病理学改变；参照Szapiel等［3］的方法，用Masson染色评定肺组织纤维化程度。

1.4.2RealtimePCR法检测大鼠肺组织 -SMAmRNA的表达严格按照RealtimePCR操作流程操作，提取大鼠肺组织 -SMARNA进行检测。引物由上海基康生物有限公司合成，-SMA（引物序列‘5-GAGCATCCGACCTTGCTAACGCCACATACATGGCAGGGACATTGAA-3’，基因序列 号：NM_031004）。

1.4.3免疫组化法检测大鼠肺组织-SMA蛋白的表达采用链霉亲和素-过氧化物酶法（SABC）检测，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。-SMA免疫组化结果以胞质出现棕色或棕黄色为阳性，每张切片在400倍视野下随机取5个视野，用高清晰图像分析系统半定量分析阳性表达部位 -SMA蛋白的表达水平，计算其平均吸光度值（MOD）作为表达水平的半定量参数。

1.5统计方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-检验，方差不齐则进行秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠行为学改变PQ中毒组大鼠染毒后出现气促、精神萎靡、反应迟钝、攻击性降低、鼠毛蓬松粗糙暗淡等表现。与同时间段PQ中毒组比较，法舒地尔干预组大鼠其呼吸、精神、反应、毛发等表现相对较轻。

2.2大鼠肺组织HE及Masson染色下的病理改变PQ中毒组（封三彩图5C1）光镜下可见肺泡间质炎症细胞浸润，肺泡结构破坏，肺泡间隔水肿，随时间延长，肺泡间隔增宽，成纤维细胞大量增生，间质大量胶原纤维沉积，明显纤维化。法舒地尔组（封三彩图5D1）肺泡炎较PQ中毒组减轻，渗出及充血减少，肺组织结构破坏减轻，肺泡间隔增宽不明显。PQ中毒组（封三彩图5C2）大鼠肺组织蓝染部分明显，色暗质硬，部分区域表面凹凸不平，切片时韧度增加。与中毒组比较，法舒地尔组（封三彩图5D2）损伤程度较轻、范围较小，韧度较轻。见封三彩图5。

2.3大鼠肺组织 -SMAmRNA的表达

正常对照组与法舒地尔对照组大鼠肺组织a-SMAmRNA呈低表达，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28d -SMAmRNA表达量显著增高，于28 d达峰值，差异有统计学意义（P＜0.05）；与同一时间PQ中毒组比较，法舒地尔干预组大鼠肺组织-SMAmRNA表达量明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4大鼠肺组织a-SMA蛋白的表达

正常对照组与法舒地尔对照组大鼠肺组织a-SMA蛋白呈低表达，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28 d a-SMA蛋白的表达量显著增高，于28d达峰值，差异有统计学意义（P＜0.05）；与同一时间PQ中毒组比较，法舒地尔干预组小鼠肺组织a-SMA蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3　讨论

PQ中毒可引起多脏器的损伤，尤以肺脏最为突出，称为PQ肺，其致病机制复杂，目前尚未完全阐明。PQ中毒早期起源于肺泡弥漫性、细胞性、肺泡内纤维化，随着PQ诱导的进一步发展，成纤维细胞增生，胶原蛋白沉积，最终导致肺纤维化［4］。成纤维细胞增生和细胞外基质过度沉积是导致肺纤维化的重要原因，而成纤维细胞转化为肌成纤维细胞发挥着重要作用。 -SMA是肌成纤维细胞的特征性标准物，是肌成纤维细胞具有收缩性的的基础［5］。Kim等［6］在输尿管结扎导致的肾纤维化中，肾组织 -SMA蛋白表达进行性升高。在本实验中发现肺纤维化越严重，-SMA相应的表达更强，部位更集中。近年研究发现阻断Rho/ ROCK通路可抑制肌成纤维细胞的产生和堆积，从而减轻组织纤维化［7-8］。法舒地尔是ROCK选择性阻断剂，是目前唯一应用于临床的抑制 Rho/ROCK信号通路的药物。王玉珍等［9］研究发现法舒地尔可以延缓肝脏纤维化的进程，并且法舒地尔对肾间质纤维化［10］及心脏纤维化［11］等均有一定的干预作用。目前，法舒地尔对肺纤维化的治疗方面研究尚少，更无治疗PQ后肺纤维化的报道。本实验通过用法舒地尔干预急性PQ中毒大鼠，发现其能明显减少-SMAmRNA和蛋白的表达，减轻急性肺泡炎及肺纤维化的程度，提示法舒地尔对大鼠肺纤维化有干预作用，但更为详细的机制还需进一步研究。

表1 4组大鼠肺组织-SMAmRNA的表达比较×10—3

表2　4组大鼠肺组织 -SMA蛋白的相对表达

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.020

R459.7

A

1671-0800（2016）07-0881-03百草枯（PQ）化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种使用非常广泛的季胺类高效能除草剂。PQ对人毒性极大，口服中毒病死率达90%以上。百草枯对全身多器官均有不同程度的损伤，尤其以肺损伤最为突出。PQ所致的肺损伤包括肺水肿、充血、呼吸衰竭和肺纤维化等［1］，肺纤维化是PQ中毒后导致呼吸衰竭死亡的重要原因。PQ中毒致肺纤维化的机制尚未阐明，迄今仍无特效治疗药物。-平滑肌肌动蛋白（-SMA）是最为常见的肌成纤维细胞的分子标志，增值表达形成纤维细胞灶，在肺纤维化中起着一定的作用［2］。法舒地尔作为一种新型、高效的血管扩张药，近年来发现其对多种器官纤维化有干预效应。本实验通过PQ灌胃染毒建立模型，检测 -SMA的动态变化，观察 -SMA在百草枯中毒肺纤维化中的作用及法舒地尔的干预效应。现报道如下。

宁波市医学科技计划项目（2013A03）

315040宁波，宁波市医疗中心李惠利医院通信作者： 何旭娟，Email：871903188@qq.com

2016-01-10