灯盏细辛上调大鼠局灶性脑缺血再灌注后VEGF的实验研究*

郭晓玲　张海波　陈　文　江雪莲（湖北省十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）



灯盏细辛上调大鼠局灶性脑缺血再灌注后VEGF的实验研究*

郭晓玲张海波陈文江雪莲△
（湖北省十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

目的 研究灯盏细辛对大鼠局灶性脑缺血再灌注后血管内皮生长因子（VEGF）的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 SD大鼠30只，采用随机数字表法随机分为对照组、模型组及灯盏细辛组，采用线栓willis环的方法造模。治疗用灯盏细辛尾静脉给药治疗10 d，先测量治疗前及第1、5、10日4个时点大鼠脑电图病理性棘波（EEG）出现次数及局部脑血流量（rCBF），再采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测治疗后缺血脑组织VEGF及VEGF受体Flk-1表达水平，并采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测VEGF-mRNA及Flk-1 mRNA表达，TTC染色观察脑梗区细胞，比较脑梗死百分率。结果 与模型组比较，灯盏细辛组大鼠VEGF、Flk-1、VEGF mRNA及Flk-1F mRNA治疗5 d后均上调，rCBF在第5、10日明显增高，EEG明显减少，脑梗死比例明显缩小 （P<0.05）。结论 灯盏细辛可上调大鼠局灶性脑缺血再灌注后VEGF及VEGF受体Flk-1表达，这对减轻脑缺血再灌注后血管内皮炎症反应程度、诱导缺血区血管内皮细胞增殖及血管新生、增加缺血区rCBF、缩小脑梗死区起到至关重要的作用，可明显改善脑缺血再灌注损伤造成的血管内皮功能紊乱。

大鼠灯盏细辛局灶性脑缺血血管内皮细胞生长因子受体

【Abstract】Objective：To study Fleabane raising VEGF after focal cerebral ischemia and reperfusion in rats，and to explore the protective mechanism against cerebral ischemia reperfusion injury.Methods：30 SD rats were divided into the control group，the model group and fleabane group.Willis′circle was used to make models.Tail vein injection of Fleabane was given for 10 days.EEG and rCBF was detected before treatment and on 1st，5th and 10thday.ELISA was used to detect VEGF and Flk-1，RT-PCR for VEGF-mRNA and Flk-1mRNA.TTC was dyed to observe the cells of cerebral infarction；the percentage of cerebral infarction was compared.Results：Compared with the model group，VEGF，Flk-1，VEGF-mRNA and Flk-1FmRNA in fleabane group all rose 5 days after treatment；rCBF rose obviously on 5thand 10thday；EEG reduced obviously，as well as Cerebral infarction ratio（P<0.05）.Conclusion：Fleabane can raise VEGF and Flk-1after focal cerebral ischemia and reperfusion，which can reduce the extent of vascular endothelial inflammation after cerebral ischemia and reperfusion，induce ischemic vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis，increase rCBF in the ischemic area，play a crucial role in reducing infarct area，and significantly improve endothelial dysfunction caused by cerebral ischemiareperfusion injury.

【Key words】Rats；Fleabane；Focal cerebral ischemia；Vascular endothelial growth factor；Receptor

急性脑梗死（ACI）发病急骤，常造成严重的伤残后遗症，病死率更高达30%以上，其病理改变主要是脑血管粥样硬化斑块脱落栓塞血管引起的急性血流障碍［1］，在使用溶栓药或扩管药治疗后，由于血液再通，常造成脑缺血再灌注损伤而加重病情，出现急性脑功能缺损而致残，严重者常导致患者死亡，是临床常见的严重威协人类健康的脑血管意外。故其治疗应重点考虑血液再通后造成脑缺血再灌注损伤，近年来临床尝试用中药制剂灯盏细辛取得了可靠疗效，但其对治疗机制特别是对ACI溶栓治疗后血管内皮再生的影响鲜有动物实验。本实验用灯盏细辛来干预大鼠局灶性脑缺血再灌注来观察其对缺血脑组织血管内皮生长因子（VEGF）及受体Flk-1表达水平的影响，以揭示其保护机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组SD大鼠30只，体质量（200± 20）g，雄性，由湖北医药学院实验动物中心提供［SCXK（鄂）2014-0008］，采用随机数字表法随机分为对照组、模型组、灯盏细辛组。用普通饲料喂养3组动物（每日50 g/kg），自由饮水，每笼1只，保证动物福利。

1.2药品与器材灯盏细辛注射液（云南生物谷药业股份有限公司，批号Z53021620）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号302-17-0）；BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟电子有限公司）。AUY120岛津电子天平（北京京海佳业科贸有限公司，型号AUY120）；大鼠VEGF及FLK-1 ELISA试剂盒（上海广锐生物科技有限公司，批号GRDS13-110，RDS13-115）；大鼠提取VEGF mRNA及FLK-1 mRNA RT-PCR试剂盒（上海广锐生物科技有限公司，批号GRDS13-106，GRDS13-107）；消毒自制尼龙栓线。

1.3造模及治疗方法按文献［2］手术步骤，所有大鼠实验前禁食12 h，不禁水，按2.5 mL/kg的用量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后仰卧位固定在大鼠手术台上，颈胸部消毒后切开颈部皮肤，分离出入颅骨的翼腭动脉并用动脉夹夹闭之以防止栓线误插入供应面部的小动脉，另一动脉夹夹闭颈总动脉，颈总动脉分颈外和颈内动脉2个分支，用眼科剪在颈内动脉剪一V形小口，将自制尼龙栓线插入18 mm或有阻力感为止（此时栓线已进入Willis环并阻断供血），阻断血流60 min后抽出丝线复灌，缝合并消毒手术创口。观察大鼠行为，当出现下例情况之一者可作为造模成功标准：1）大鼠左前爪内收，或因前爪内收造成步态不稳；2）提起大鼠尾巴，悬空时左前爪不能伸展，左侧前爪内收，行走时向左侧转圈。对照组10只大鼠手术步骤同上但不插入栓线阻断血流作为对照。造模成功后灯盏细辛组按10 mg/kg的用量将灯盏细辛注射液从尾静脉注射给药，每日1次，对照组及模型组尾静脉注射1 mL 0.9%氯化钠注射液，3组都治疗10 d。

1.4大鼠脑梗死百分率在治疗10 d时，从3组大鼠中取5只，断头处死动物，迅速分离全部脑组织，滤纸吸干组织液，称重后编号，-20℃低温冰箱冰冻30 min，然后取出，用切片机以冠状面切成厚2 mm的脑薄片，37℃的1%TTC溶液避光染色，30 min后用4%的多聚甲醛固定。高倍显微镜下观察脑薄片，脑薄片梗死区经TTC染色后着色会加深，小心剥离出着色梗死部分称重并计算脑梗死百分率，脑梗死百分率（%）=（梗死质量/总质量）×100%。

1.4大鼠基因检测方法用BL-420F生物机能实验系统记录治疗前后EEG，用记录治疗前后RCBF。按文献方法［3］，在治疗10 d从3组大鼠中取另5只，断头处死动物，分离脑组织编号后至-7O℃低温冰箱，采用酶联免疫吸附法 （ELISA）检测治疗前后缺血脑组织VEGF及其受体Flk-1表达水平。VEGF及VEGF受体Flk-1检测方法参照文献［4］，取低温冰箱暂存的脑组织标本1/2，研磨后放入匀浆器中匀浆，3000 r/min离心30 min，严格按VEGF及其受体Flk-1的ELISA试剂盒说明操作，酶标仪读数取 VEGF及VEGF受体Flk-1表达值。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测VEGF-mRNA及Flk-1mRNA表达OD值。检测时先对标本进行RNA提取，RT-PCR引物设计如下。FIK-1 mRNA上游引物：F 5'-TTAGGGGTGGGGTGGG G-3'。下游引物：R 5'-CTACTCCACTACCAAG-3。VEGF上游引物：F 5'GCGAAGCGAATTTCCAACAGA CG-3'。下游引物：R 5'GCGGTCGACATAGAGCTTGT AGGA-3'。VEGF-mRNA及Flk-1mRNA用上述引物扩增DNA片段。设计PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，35个循。PCR扩增后产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以DNAMarker标记确定条带大小，经全自动凝胶成像分析系统进行扫描摄像以确定灰度比值（OD值）。

1.6统计学处理应用SPSS19.0统计软件处理。数据以（±s）表示，符合正态分布，方差齐时采用t检验，方差不齐时采用校正t检验。治疗前及第1、5、10日4个时点大鼠EEG及rCBF采用重复测量方差分析，梗死比例以百分率表示，采用χ2检验，检验水准为0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠脑梗死百分率比较见表1。治疗10 d病理图片显示，对照组着色均匀，神经纤维无坏死溶解，细胞排列整齐。模型组梗死区着色加深，神经细胞排列紊乱，有一部分已溶解，病理图片显示出现明显坏死灶，梗死百分率为30.07%。灯盏细辛组有少量着色加深区，有极少部分的脑组织神经胶质细胞溶合，细胞排列整齐，脑梗百分率16.93%，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示灯盏细辛具有扩张梗死区微动脉、减少梗死百分率的作用。

表1　各组大鼠脑梗死百分率比较（±s）

表1　各组大鼠脑梗死百分率比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。下同。

组别　　正常（g）　　梗死百分率（%）对照组　0.121±0.014　0.00 n　　梗死（g）5　0.000±0.000模型组　0.085±0.016△　30.07*5　0.037±0.014△灯盏细辛组　5　0.021±0.012*0.104±0.008*　16.93*

2.2各组大鼠基因指标比较见表2。模型组VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明显低于对照组（P＜0.05）。灯盏细辛组VEGF、VEGF mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明显增强，与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），提示灯盏细辛能够促进缺血区组织VEGF的表达，改善缺血部位脑组织血管新生。

表2　各组大鼠基因指标比较（±s）

表2　各组大鼠基因指标比较（±s）

组　别　n VEGF（ng/mL）VEGF mRNA（pg/mL）FLK-1（ng/mL）FLK-1 mRNA（pg/mL）对照组　5模型组　5 4.78±0.13　0.82±0.09　2.58±0.07　0.69±0.05 2.59±0.05△　0.60±0.10△　1.07±0.11△　0.27±0.09△灯盏细辛组　57.79±0.24*　1.74±0.13*　4.49±0.16*　2.82±0.12*

2.3各组大鼠脑缺血再灌注后EEG及rCBF的比较见表3。BL-420L生物信号采集记录显示，模型组大鼠脑缺血再灌注后第1、5、10日EEG明显增多，rCBF降低，与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），这说明脑缺血再灌注后损伤严重。灯盏细辛组第5、10日EEG明显减少，rCBF增多，与模型组相比，经重复测量方差结果显示球形假设检验P＜0.05，故不服从球形假设，因此F=152.87，P＜0.05；多变量检验结果中时间和分组交互作用，差异有统计学意义（P＜0.05），说明灯盏细辛能显著降低大鼠脑缺血再灌注后抑制缺血异常，故脑电图中异位棘波出现次数，改善微循环增加脑血流量的作用。

表3　各组大鼠脑缺血再灌注后EEG及rCBF比较（±s）

表3　各组大鼠脑缺血再灌注后EEG及rCBF比较（±s）

组 别　　时 间　EEG（Times/min）（rCBF=mL/100 g·min）对照组　　治疗前　0.02±0.01　54.92±6.32 （n=5）　1 d　0.00±0.00　59.21±7.85 5 d　0.01±0.01　55.78±2.0 10 d　0.00±0.00　54.71±2.49模型组　　治疗前　69.23±7.16△　23.35±4.90△（n=5）　1 d　70.12±8.32△　25.91±4.02△5 d　61.82±6.21△　21.32±1.57△10 d　66.74±6.72△　23.54±3.37△灯盏细辛组　治疗前　67.81±7.21△　25.71±3.38△（n=5）　1 d　70.21±7.87△　27.02±3.07△5 d　31.37±5.30*△　33.27±4.97*△10 d　12.54±3.25*△　42.51±4.77*△

3　讨　论

ACI的临床症状和预后有赖于缺血区动脉侧支循环的重建，因此，积极寻找具有促进缺血血管新生的药物对缺血性疾病治疗具有重大意义。灯盏细辛中药名灯盏花，富含灯盏花乙素、总黄酮、总咖啡酸酯、总咖啡酸酯、野黄芩苷、高黄芩素、二咖啡酰、奎宁酸酯等［5］。药用菊科植物短葶飞蓬之全草，性温、味辛甘，具有消积止痛、活血化瘀之效。灯盏细辛注射液是灯盏细辛全草现代工艺提取的酚酸类灭菌注射液，主要有效成分灯盏花乙素、总黄酮、总咖啡酸酯及野黄芩苷，具有激活纤溶酶的活性及扩张血管的作用，还具有抗凝、溶栓、清除自由基、抑制炎症因子释放及机体脂质过度氧化的药理效应［6］，临床主要用于治疗缺血性中风、冠心病心绞痛等。

血管内皮功能的完整性取决于机体氧自由基的生成与清除，一般情况下，氧自由基的生成与清除保持动态平衡，血管内皮功能保持正常。当血管狭窄或栓塞，特别是ACI时，脑组织局部血管急性血流障碍造成急性缺血缺氧，ATP供应不足，细胞Na-K+-ATP大量释放，Ca2+内流并有可能造成钙超载，细胞内钙超载会破坏线粒体结构及功能，进一步导致能量代谢紊乱，机体氧自由基、白细胞介素-2及前列腺素也大量产生，造成血管内皮细胞受损严重［7］。VEGF具有增加微、小静脉血管的通透性、促使血管内皮细胞分裂增殖及诱导血管生成再生等作用［8］。VEGF又分B、C、D等亚型，对缺血后血管内皮再生都有相似的作用［9］。VEGF的受体Flk-1在损伤组织上会大量表达，其增多说明VEGF的活性增强。

在本实验中，模型组VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA表达均有不同程度的下降，大鼠脑缺血再灌注后EEG增多，rCBF急剧下降的，说明缺血再灌注造成了严重损伤，且是不可逆的。模型组梗死百分率高达30.07%，灯盏细辛组TTC染色显示有少量着色加深区，有极少部分的脑组织神经胶质细胞溶合，细胞排列整齐，脑梗百分率16.93%，提示灯盏细辛具有扩张梗死区微动脉、减少梗死百分率的作用。灯盏细辛组VEGF及FLK-1、VEGF mRNA及FLK-1 mRNA在治疗后表达均明显上调，说明灯盏细辛可增加FLK-1的数量，使VEGF表达上调，这对诱导缺血脑组织血管新生，促进受损血管内皮修复具有肯定作用。其机制可能与灯盏细辛活血化瘀的药理作用有关，一方面可能抑制ATP酶过多释放，降低细胞内钙超载的可能，也可能通过Na-K+-ATP酶调节Na+-H+交换来抑制Na+-Ca2+交换，经阻止过多的Ca2+内流来改善缺血脑组织能量代谢［10］。由于VEGF对血管内皮细胞具有特异性的促有丝分裂作用［11］，可促进缺血脑组织内血管分化和生成，这对侧支循环血管重塑和建立具有重要意义［12］。实验表明，灯盏细辛具有增加VEGF的受体 FLK-1表达作用，FLK-1增多进一步。促进VEGF的合成与分秘增加，促进血管内皮损伤后血管内皮再生，进而促使血管重塑而达到维持血管的完整性的目的；另一方面，灯盏细辛扩张脑血管，抑制炎性介质的形成或释放，防止缺血脑神经元损伤，改善神经细胞功能，还可使机体内排肤类被激活，清除局部组织的五羟色胺等致敏原，降低神经兴奋性，消除异常放电（实验中EEG减少），增加rCBF，改善微循环，增加脑组织供氧有关。在ACI时，脑组织供血供氧有赖于缺血侧支循环的形成，这可以减轻脑组织的缺血缺氧现象，避免脑组织缺血坏死，改善血液再通后造成脑缺血再灌注损伤后的临床症状。总之，注射灯盏细辛可起扩张局部微血管，增加组织灌注，改善局部血液循环，消除局部炎症，达到活血化瘀、止痛消积之功效［13］。但缺血再灌注损伤有多因素参与的复杂代谢过程，灯盏细辛如何在各个环节发挥调节及干预、阻断缺血/再灌注损伤的发生，还有待深入研究。

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Research of Fleabane Raising VEGF after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion in Rats

GUO Xiaoling，ZHANG Haibo，CHEN Wen，et al. Orthopedics Department，Taihe Hospital of Shiyan，Hubei Medical College Affiliated Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0985-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.012

湖北省教育厅科研项目（15D081）

△（电子邮箱：guoxiaolingxl@126.com）

（2016-01-30）