脑缺血再灌注大鼠灌胃养阴通脑颗粒后主要成分葛根素的药动学研究*

韩　进　范红晶　杨洁红　李　敏　张宇燕（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）



脑缺血再灌注大鼠灌胃养阴通脑颗粒后主要成分葛根素的药动学研究*

韩进范红晶杨洁红李敏张宇燕△
（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

目的 采用脑-颈静脉双通道微透析法观察大鼠灌胃养阴通脑颗粒后主要成分葛根素的药动学参数。方法 采用HPLC技术建立大鼠脑和颈静脉微透析液中葛根素的含量测定方法，并考察微透析探针回收率；大鼠植入颈静脉和脑微透析探针引导管，并制作大鼠大脑中动脉局灶性栓塞（MCAO）模型。灌胃给予2.5 g/mL养阴通脑颗粒，测定脑、颈静脉微透析液葛根素的浓度变化，参数拟合分析药动学参数。结果 观察MCAO模型大鼠灌胃给予2.0 g/mL养阴通脑颗粒后微透析液中葛根素的浓度，发现脑内葛根素浓度低于颈静脉，Tmax更加靠后，葛根素生物利用度在脑部明显低于血液中。结论 建立的脑-颈静脉双通道微透析技术分析获得大鼠不同部位的药-时曲线，有助于开展中药及相关制剂的药动学数据及成分分布、生物利用度等参数。

脑-颈静脉双通道微透析脑缺血再灌注养阴通脑颗粒葛根素药动学

【Abstract】Objective：To study the pharmacokinetics of Puerarin in cerebral ischemia-reperfusion rats after intragastric administration of Yangyin Tongnao decoction by brain-jugular dual-channel microdialysis.Methods：HPLC was adopted to establish the determination method of Puerarin in microdialysates of cerebral and jugular veins，and the recovery rate of probe was detected.The guide tube was used to insert the jugular vein and brain microdialysis probe，making rats model of focal middle cerebral artery occlusion（MCAO）.After intragastric administration of 2.5 g/mL Yangyin Tongnao decoction，the concentration of puerarin in brain and neck vein microdialysates were detected by using parameter fitting to analyze the pharmacokinetic parameters.Results：By observing the concentration of puerarin in brain and neck vein microdialysates after intragastric administration of 2.5 g/mL Yangyin Tongnao decoction in MCAO models，the the concentration of puerarin in brain was lower than that in neck vein，as well as Tmax.Bioavailability of Puerarin in brain was obviously lower than that in the blood. Conclusion：obtaining different parts of the concentration-time curve by using the brain-jugular dual-channel microdialysis，it will be beneficial to the pharmacokinetic analysis of traditional Chinese medicine（TCM）and pharmaceutics and the study of composition distribution，bioavailability，and so on.

【Key words】Brain-jugular vein dual-channel microdialysis；Cerebral ischemia-reperfusion；Yangyin Tongnao decoction；Puerarin；Pharmacokinetics

微透析采样技术（Microdialysis）是将一种具有半透膜的探针置于实验动物的特定组织中，利用泵推送溶液至探针处，使组织内的目标物质通过半透膜扩散到探针内，以达到从组织内取出需要测量的低分子量物质的目的，以便进一步的分析。这种取样技术将灌流取样和透析技术相结合，具有活体、原位连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻、在线检测等特点。目前该技术被广泛应用于各种生理病理现象的探索性实验和神经生物化学的监测等［1］。由于血脑屏障阻挡了病原生物及其他大分子物质由血液循环系统进入脑室和脑组织中［2］，从而影响药物进出脑部的转运过程，导致脑内和血液中的药物浓度不完全一致。而血-脑双通道微透析技术结合HPLC技术，可同时检测脑部细胞外液中游离药物浓度与血液中药物浓度，更客观地反映药物通过血脑屏障的程度及药物在脑内的分布和清除状况［3］。研究动物给药后透过血脑屏障有效成分的比例对进一步明确其临床疗效有积极意义。

养阴通脑颗粒是由野葛根、生地黄、生黄芪和川芎等制成的无糖颗粒，具有益气活血、扩张血管、抗栓等功效［4］。养阴通脑颗粒目前已获得国家食品药品监督管理局临床研究批件，在临床主要用于治疗脑血管疾病。其中主要组成药物葛根中的葛根素可改善心脑血管循环，增强心肌收缩力，保护心肌细胞、降低心肌耗氧量，降低血压，具有抗血小板聚集，降低血糖等多种药理作用［5-7］。本实验采用双通道微透析取样技术，在不同时间点通过大鼠颈静脉和脑部植入的微透析探针引导管，同步取脑和颈静脉微透析液，结合高效液相色谱法，给予脑缺血再灌注模型大鼠灌胃养阴通脑颗粒后检测葛根素的血药浓度和脑药浓度，从而探讨灌胃养阴通脑颗粒后葛根素的脑内、颈静脉内的药动学变化情况。现报告如下。

1　材料与试剂

1.1仪器

高效液相色谱仪：日本岛津LC-10AD，紫外检测器。微透析设备：灌注器推进泵（Baby Bee Syringe Drive MD 1001），灌注器 （1 mL Bee Stinger Gastight Syringe，MD 0100），灌注器支架（3-Syringe Bracket for Baby Bee，MD 1002），流速控制器 （Work Bee Controller，MD 1000）（均为美国BAS公司），颈静脉微透析探针（膜长10 mm，截留相对分子质量为18000D，美国Spectrum公司），脑微透析探针（膜长4 mm，截留分子量为18000 D，美国Spectrum公司），以上均为浙江大学生物工程与仪器分析学院提供；AG135电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产。

1.2药物与试剂

养阴通脑颗粒：浙江中医药大学心脑血管病研究所提供，批号2009L00307。葛根素标准品：中国药品生物制品检定所，批号：110752-201009，HPLC检测纯度＞98%。甲醇（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司生产）；其余均为分析纯。

1.3实验动物

老年清洁级SD大鼠，体质量（275±25）g，2月龄，雄性，购于浙江中医药大学动物实验中心，实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准，动物许可证号SCXK（沪）2013-0016。实验前12 h禁食，自由饮水。

2　方法与结果

2.1养阴通脑颗粒溶液的制备

称取养阴通脑颗粒用0.9%氯化内注射液配制成2.0 g/mL的溶液。

2.2颈静脉及脑微透析探针引导管植入［6］

2.2.1大鼠颈静脉微透析探针引导管植入称体质量后用水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉，在背颈部开口，左颈静脉处开两口；用透皮针将引导管从背颈部沿皮下穿到颈静脉上口，并用细棉线将其固定在颈部上口处；用透皮针将引导管从上口穿到下口，将两股细棉线穿过下口上部备用；暴露颈静脉，将血管两端打活结；将引导管穿入静脉约8 mm；用粗棉线将血管连同引导管系牢，用细棉线使引导管固定在皮肤上；观察回血，注入少量肝素后缝合皮肤；背部用棉线将引导管固定在皮肤出口处。

2.2.2大鼠脑微透析探针引导管植入将透析套管定位于右侧纹状体并使用牙科水泥固定在颅骨上，术后肌注青霉素消炎。在25～30℃条件下恢复5～7 d，外形无萎靡不振等不良手术反应。

2.2.3术后护理肌注青霉素，用热光灯照射12h使其恢复体温，隔天在引导管中注入0.1 mL肝素；22℃左右温度下大鼠恢复3 d，直至恢复正常的行动与饮食，外形无不良手术反应等。

2.3大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立

大鼠水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，暴露右侧颈总动脉（CCA），颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。用丝线将远心端的颈外动脉结扎，并在颈外动脉近分叉处栓线备用，用微型动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。在颈外动脉近分叉处剪一小口，将一段头端光滑圆球的鱼线，自开口插入，轻柔推进栓线，轻开颈内动脉上的动脉夹，使栓线沿颈内动脉进入到大脑中动脉（MCA）的起始端，用备用丝线固定栓线，从颈外动脉分叉处到遇到阻力点（脑中动脉起始处）约18～20 mm即可，并记录开始缺血时间［9］。整个过程用照明灯保持直肠温度在36～37℃。缺血1 h后退栓线，打开颈总动脉上的动脉夹行再灌注。在再灌注同时灌胃给予2 g/kg养阴通脑颗粒 （根据葛根素含量计算葛根素浓度为6.75 mg/mL）。

2.4血、脑内透析液的收集

开启微透析灌流系统，灌注液为0.9%氯化钠注射液，灌速2 μL/min，平衡10 min后开始收集透析液，每10分钟收集1次，HPLC检测无干扰峰后，行MCAO术，再灌注60 min后每15分钟收集一次透析液，直至采集体积为50 μL，透析液高效液相分析。

2.5脑-颈静脉透析液中葛根素含量测定方法的建立

2.5.1葛根素对照品溶液的配制精密称取1.0 mg葛根素对照品，用70%甲醇-水溶解，并定容至10 mL，配成浓度为0.1 mg/mL准溶液，再取0.1mL葛根素标准溶液，定容至100 mL，得到浓度为0.1 μg/mL的葛根素标准溶液。同法配制0.025 mg/mL的对羟基苯甲酸标准溶液作为内标。

2.5.2色谱条件固定相：phenomenex GEMINI C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm。流动相：甲醇-0.5%醋酸（27∶73，v∶v）。柱温：25℃。流速：1.0 mL/min，紫外检测波长：250 nm。进样量：10 μL，理论塔板数以葛根素计均大于5000。

2.5.3标准曲线及最低检测限取空白透析液0.3 mL，分别加入葛根素标准溶液制成梯度质量浓度为：0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL，在每管中分别加入内标液15 μL。以葛根素和内标物的峰面积比值与葛根素的浓度作线性回归，达到葛根素的线性回归方程为：Y=2.5766x-0.049，R=0.9994，在0.025～0.8 μg/mL范围内，葛根素呈良好的线性关系。测得信噪比为3时的最低检测限为0.015 ng，最低检测质量浓度为5 ng/mL。色谱分离见图1。

图1　葛根素高效液相色谱图

2.5.4精密度实验以空白透析液作底物，分别加入葛根素对照品使质量浓度分别为0.025、0.2、0.8 μg/mL （n=6），测定同1 d内不同时间和在不同天数葛根素含量，结果日内精密度分别为4.02%、2.78%、2.83%，日间精密度分别为5.37%、3.65%、6.17%。

2.5.5回收实验空白透析液中分别加入高、中、低3个浓度的葛根素标准溶液，质量浓度分别为0.025、0.4、3.2 μg/mL（每个质量浓度平行做5份），在每管中分别加入内标液15 μL，按照标准曲线项下方法处理样品，测定回收率。结果平均回收率为（92.45±1.38）%，（85.37±3.28）%，（88.38±2.28）%，RSD为7.65%，4.37%，5.23%。

2.6微透析探针回收率测定［10］

利用体外血浆溶液考察探针相对回收率：在体实验前分别将脑微透析探针和静脉微透析探针放入10 μg/mL葛根素血浆溶液浸泡。0.9%氯化钠注射液作为灌注液，将0.9%氯化钠注射液以2μL/min流速进行灌注，平衡30 min后，每次收集透析液30 μL，收集3次，灌注6 h。体外回收率（Recgain）的计算公式为：

其中，cdial为透析液中平均药物浓度；cm为探针的环境药物浓度。由公式计算探针相对回收率分别为（10.12±0.17）%，（10.24±0.13）%。

2.7脑-颈静脉透析液中葛根素浓度的测定及药动学参数计算［11］

分别测定不同时间点脑、颈静脉透析液中葛根素的浓度，透析液收集过程中的平均值即为微透析分析的血药浓度，将该浓度的时间近似记为采集的时间中点值，见图2。采用中国药理学会3P97药动学软件，将葛根素动态血药浓度变化数据进行计算并拟合判别，得到葛根素的药动学各项参数，结果见表1。从图1和表1中可以看出脑部药物的分布明显低于颈静脉部位的药物分布，脑部Cmax低于颈静脉处；脑部Tmax更加靠后，脑部生物利用度明显低于血液中。

图2　颈静脉微透析和脑部微透析液中葛根素浓度经时变化曲线对比（μg/mL，n=8）

表1　大鼠脑和颈静脉多通道微透析葛根素药代动力学参数（±s）

表1　大鼠脑和颈静脉多通道微透析葛根素药代动力学参数（±s）

药动学参数　　颈静脉微透析Cmax（μg/mL）　0.46±0.01 Tmax（min）　73.35±0.56 HVD（min）　40.14±0.43脑微透析0.36±0.02 89.61±0.63 39.08±0.53 AUC0-∞［min/（μg·mL）］　27.49±2.27　17.67±3.02 AUMC0-∞　2543.90±120.30　1542.41±117.90 MRT0-∞（min）　92.54±9.21　87.31±9.00

3　讨　论

葛根素在治疗心脑血管疾病方面有很好的疗效，已有较多的相关文献报道证实，但对于葛根素在同一时间、不同部位的药动学比较目前尚未见研究报道，因此，本实验的研究对于提高养阴通脑颗粒的有效成分在体内的分布、以及生物利用度等研究有极大的指导意义。

本实验结果显示，脑部葛根素的分布明显低于颈静脉部位，脑部葛根素的高峰值低于颈静脉处葛根素的峰值；脑部Tmax更加靠后，脑部葛根素高峰的出现较颈静脉晚，说明脑部生物利用度明显低于血液生物利用度。若采用常规的药动学研究血药浓度的分析方法，不仅对动物刺激大，还会对药物的药动学过程产生较大的影响，又因小动物血容量小，多次取血可能会影响药物的分布与代谢，故不适合此次实验。微透析技术由于其优势突出，可在颈静脉内进行连续微透析采样［13］，可在不同组织、不同器官或同一器官不同部位同时分别取样，实现清醒动物多部位的药物浓度测定，有助于阐述药物的体内过程、分布、作用机制及靶向性，在医学、药学、生命科学等研究领域中越来越得到广泛应用［12］。

本实验通过建立脑-颈静脉双通道微透析技术结合HPLC技术测定从而获得不同部位的药-时曲线，同时检测脑内细胞外液的游离药物浓度与血液中药物浓度，客观地反映葛根素在脑组织、血液中的分布、吸收、代谢等情况。其次药物在脑部的转运吸收与血脑屏障（BBB）密切相关［14-15］，血脑屏障能够阻止某些物质进入脑组织，因此，葛根素在脑内的分布、吸收可能与BBB相关，而微透析技术能够准确地检测脑组织中游离型药物的含量、分布。葛根素在脑组织中的浓度明显低于颈静脉中浓度，表明葛根素是与血浆蛋白进行了结合［16-17］，因此不能发挥相应的药物作用，使游离型药物含量降低，降低了血脑屏障通过率，降低了在脑内的含量，因此在以后的研究中，需要深入研究葛根素与血脑屏障之间的作用机制，以提高葛根素在脑内组织的分布等情况，使养阴通脑颗粒在治疗心脑血管疾病方面取得更好的临床疗效，可更好地为指导临床用药提供合理的理论依据。

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Pharmacokinetics Research of Puerarin on Cerebral Ischemia-reperfusion Rats after Intragastric Admin-istration of Yangyin Tongnao Decoction by Brain-jugular Vein Dual-channel Microdialysis

HAN Jin，FAN Hongjing，YANG Jiehong，et al.Zmixtureang University of Chinese Medicine，Zmixtureang，Hangzhou 310053，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0945-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.002

国家自然科学基金（81403284，81374053）；浙江省中医药科技计划项目（2013ZA029）

△（电子邮箱：yannoo7376@sina.com）

（2015-08-20）