东莞汉族人血清PCSK9水平与冠心病关系的研究

钟孟如，刘忠民，万德胜，李伟其，莫玉前 （广东省东莞市人民医院检验科，广东东莞523059）

·基础与转化医学·

东莞汉族人血清PCSK9水平与冠心病关系的研究

钟孟如，刘忠民，万德胜，李伟其，莫玉前 （广东省东莞市人民医院检验科，广东东莞523059）

【摘 要】目的：探讨广东东莞地区汉族人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9（PCSK9）的血清学水平及其与冠心病的相关性.

方法：选取广东省东莞市人民医院2014-06/2015-06经冠脉造影确诊的60例冠心病患者的血清标本和60例非冠心病对照组的血清标本，用ELISA测定血清PCSK9水平，用酶法测定血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的浓度水平.结果：冠心病组的血清PCSK9水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），冠心病组的CHOL、TG、LDL水平均高于非冠心病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PCSK9水平与TCH、TG、LDL⁃C的相关系数是0.458，0.460，0.429（P＜0.05）；冠心病组的女性PCSK9水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），冠心病组在＜60岁的年龄阶段PCSK9水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）.结论：PCSK9水平可作为预测冠心病的一个血清学指标，且PCKS9水平与血脂水平、年龄、性别密切相关.

【关键词】PCSK9水平；冠心病；血脂水平；年龄；性别

0　引言

流行病学调查显示，血脂水平异常是造成冠心病（coronary heart disease，CHD）死亡率及催患率增加的主要因素.前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subti1isin/kexin type 9，PCSK9）基因是除LDLR和ApoB100之外，第三个与常染色体显性家族性高胆固醇血症有关的基因. PCSK9 cDNA的大小为3617bp，编码692个氨基酸组成的PCSK9蛋白，主要在肝脏、肠道表达，少量表达于肾脏、皮肤、脑中［1］.PCSK9通过结合于低密度脂蛋白受体（LDL receptor，LDLR）的表皮生长因子（epiderma1 growth factor，EGF）样结构域，与LDLR共同内化，抑制LDLR的释放与返回细胞膜，诱导LDLR进入溶酶体内降解，细胞表面LDLR数量的减少将导致血浆低密度脂蛋白胆固醇（1ow⁃density1ipoprotein cho1estero1，LDL⁃C）的水平升高［2］.PCSK9的突变基因于2003年首次被报道［3］，其突变分为功能获得型和功能缺失型，功能获得型突变可增强PCSK9上调LDL⁃C的能力［4］，功能缺失型则相反.本实验拟探讨血清PCSK9水平与血脂水平、CHD之间的关联性，为CHD的个性化治疗、疗效判断等提供依据.

1　资料和方法

1.1一般资料 选取广东省东莞市人民医院心血管内科2014-06/2015-06经冠脉造影确诊的60例CHD患者的血清标本和60例非CHD对照组的血清标本，CHD患者中男45例，女15例，年龄（65.13± 14.63）岁；非 CHD患者中男39例，女21例，年龄（49.03±16.91）岁.

1.2纳入标准 广东东莞汉族人，CHD患者有胸痛症状，心电图ST⁃T改变，冠脉造影显示左主干、左前降支、左回旋支及右冠状动脉中，至少有一支血管狭窄≥50%.健康人群经询问病史、体检及心电图、胸部X线射片等检查，排除心血管疾病历史，未发现血脂、肝功能异常，年龄、性别与CHD患者组相近.

1.3排除标准 组内及组间个体有血缘关系者；有糖尿病、肝肾疾病以及其他内分泌异常疾病者；健康对照组检查发现有心血管疾病者及其他不合适者.

1.4主要试剂与仪器 试剂：PCSK9 ELISA试剂盒（R&D Systems，Inc），EB（捷倍思），血脂试剂（贝克曼公司）.仪器：离心机（Eppendorf公司），酶标仪（Bio⁃TekELX800），微量可调移液器（Eppendorf公司）；贝克曼全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）.

1.5方法

1.5.1冠状动脉造影及病变程度评估 采用Judkin's法，用6F左右造影管以Se1dinger技术穿刺右股动脉途径进行造影.应用Gensini积分法［5］对入选病例的冠脉造影结果进行评分：无狭窄，0分；狭窄≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分.不同的血管病变部位有对应的系数：左主干，×5；前降支近段，回旋支近段，×2.5；前降支中段，×1.5；回旋支开口处，×3.5；前降支第一对角支、第二对角支、心尖部，回旋支的钝缘支、远段，右冠状动脉近段、中段、远段，后降支，×1；左室后侧支，×0.5.用血管狭窄程度评分乘以病变部位对应的系数，每位患者的最终积分为各分支积分之和.

1.5.2标本采集 采集CHD组与对照组的空腹外周静脉血，3000 r/min离心10 min分离收集血清1000 μL于EP管，于-80℃保存.CHD组于入院第一次生化检测当天收集标本，健康人群血液标本于体检当天收集.

1.5.3生化指标测定 收集样本当天完成肝肾功能、血脂等项目测定.血清总胆固醇（tota1 cho1estero1，TC）、血清甘油三酯（trig1yceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density 1ipoprotein cho1estero1，HDL⁃C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL⁃C）均采用酶法检测.

1.5.4ELISA法检测血清中PCSK9水平 Ca1ibrator Di1uent RD5P与去离子水1∶5配 Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液；Human PCSK9 standard干粉加2.0 mL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液，配成40 ng/mL的Human PCSK9 standard标准液；加100 uL的Di1uent RD 1-9到每个反应孔；标准液用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液做倍比稀释，得到浓度为0.625 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40 ng/mL的标准液；血清标本用Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液稀释20倍；将50 μL 的Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液、各浓度的标准液、血清标本加到反应孔，Ca1ibrator Di1uent RD5P稀释液、各浓度的标准液每板各加样两孔，标准品浓度从低到高；室温静置避光2 h后用Wash buffer洗涤四次；加200 μL的Human PCSK9 Conjugate到每个孔；室温避光静置 2 h后，Wash buffer洗涤四次；将 Co1or reagents A与Co1or reagents B混合配制成 Substrate so1ution，15 min内将200 μL的Substrate so1ution加到每个孔，避光孵育30 min；加50 μL的终止液 Stop so1ution，混匀后，30 min内酶标仪450 nm读取数据，分别用两板的标准曲线算出血清标本的浓度（图1、2）.

图1　第一板的血清PCSK9标准曲线1

图2　第二板的血清PCSK9标准曲线2

1.5.5他汀药物治疗CHD前后PCSK水平比较 检测他汀类药物治疗后3个月的CHD患者血脂水平，并与治疗前的血脂水平进行比较.

1.6统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用±s表示，组间比较用t检验，组间比较采用单因素方差分析，不同指标间的相关性分析采用Pearson分析法，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2　结果

2.1两组的PCSK9、血脂水平比较 CHD组的血清PCSK9水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；CHD组的TCH、TG、LDL⁃C均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）.

表1　两组的PCSK9水平、血脂水平比较（n=60，±s）

表1　两组的PCSK9水平、血脂水平比较（n=60，±s）

aP＜0.05 vs对照组；bP＜0.01 vs对照组.

组别　PCSK9（ng/mL）　TCH（mmo1/L）　TG（mmo1/L）　HDL⁃C（mmo1/L）　LDL⁃C（mmo1/L）对照组　305.59±68.86　4.18±0.63　1.11±0.31　1.72±0.22　2.82±0.55 CHD组　359.96±102.28b　4.83±1.32a　1.45±0.61a　1.10±0.28　3.38±1.12a

2.2PCSK9水平与血脂水平相关性分析 对照组与CHD组的 120例标本，PCSK9水平（424.88± 100.94 ng/mL）与 TCH（4.34±1.33 mmo1/L）、TG （1.24±0.54 mmo1/L）、LDL⁃C（2.99±1.05 mmo1/L）的相关系数分别是0.458、0.460、0.140、0.429，说明血清PCSK9水平与TCH、TG、LDL⁃C线性相关（表2）.

表2　PCSK9水平与血脂水平相关性分析

2.3CHD组的Gensini积分与PCSK9水平的相关性 将CHD患者根据Gensini积分分为三组，轻度组＜25分，中度组25～49分，重度组≥50分，仅轻度组的PCSK9水平与Gensini积分线性相关（r=0.647，P＜0.05，表3）.

表3　PCSK9水平与血脂水平相关性分析

2.4不同性别、年龄的PCSK血清学水平比较 统计发现男性与女性在组内比较，以及不同年龄阶段的组内比较，PCSK血清学水平均无统计学意义（P＞0.05）；男性与女性分别进行组间比较，女性间有显著差异［对照组（49.54±16.84）岁，CHD组（68.26± 11.85）岁，P＜0.05］；不同年龄段进行组间比较，在＜60岁年龄段差异有统计学意义（P＜0.05，表4）.

表4　不同性别、年龄间的PCSK血清学水平比较

3　讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称CHD，是一种多因素、多基因性疾病，具有遗传易感性［6］，血脂水平异常是造成CHD死亡率及催患率增加的主要因素.血清中60%～70%的胆固醇通过低密度脂蛋白运输［7］，LDL⁃C主要通过肝细胞表面的LDLR清除，LDL⁃C增高是动脉粥样硬化的一个主要危险因子.

他汀类药物是目前临床上应用最广泛的降脂药物，其机制为抑制肝脏胆固醇合成过程中的限速酶3⁃羟基⁃3⁃甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG⁃CoA还原酶）的活性.在高胆固醇血症患者中，他汀类药物应用到最大允许剂量时可使LDL⁃C降低50%～60%［8］.但仍有约5%～10%的患者，尽管同时通过饮食和医疗，LDL⁃C仍在70 mg/dL的目标以上，且他汀类药物剂量加倍，LDL⁃C水平只能再降低6%.产生这种现象的因素有多方面，细胞实验发现，在使用西立伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀等处理人肝癌细胞HepG2及人原代肝细胞后，PCSK9呈浓度依赖性表达上调，其机制考虑为LDLR启动区及PCSK9启动区的SRE⁃1均能与低胆固醇激活的SREBP⁃2结合，激活转录机制使LDLR、PCSK9的数量均增加，因此影响了他汀药类物降低LDL⁃C的作用.因此，当使用他汀类药物治疗后，出现血清学PCKS9水平持续升高时，应当考虑更换患者降脂的首选药，或他汀类药物与其他降脂药的联合使用.他汀类药物的副作用主要是肌痛和肝酶升高，美国国家脂质协会的一项调查发现，约12%的患者会中止他汀治疗，其中62%的患者是出于副作用的原因.因此，不能耐受他汀类药物治疗的患者可考虑使用无此副作用的PCKS9抑制剂［9］.赛诺菲Pra1uent及安进的Repatha均将上市，有可能成为未来降脂药物的热点.

PCSK9的基因突变分为功能获得型和功能缺失型，功能获得型突变导致严重的高胆固醇血症和早发型CHD，增加心脑血管事件的发生率，功能缺失型则相反.研究发现，PCSK9基因变异均存在种族与性别的差异［10-12］，故PCSK9血清学水平存在个体化差异，该差异的存在对CHD的诊断、治疗及预后观察具有一定的价值.

研究结果显示，CHD组的血清PCSK9水平显著高于对照组（P＜0.01），提示PCSK9可作为预测CHD的一个血清学指标.同时，血清PCSK9水平与TCH、TG、LDL⁃C线性相关，当血脂水平高时，提示进行PCSK9水平检测，可辅助CHD的诊断［13］.在Gensini积分的轻、中、重三组中，PCSK9均值水平虽然随着Gensini积分的增加而上升，但仅与轻度组线性相关（P＜0.05），其机制尚未可知.CHD组的女性PCSK9水平显著高于对照组，该现象考虑与女性的绝经期有关［14］，现已证明体内雌激素是重要的血管保护因子，可使女性的CHD较男性晚发生10年［15］，但Lakoski等［16］认为雌激素水平与PCSK9在绝经前的表达差异无关，而Persson等［17］的研究却表明雌激素可以降低血浆中的PCSK9水平，因此雌激素是否影响PCSK9尚需进一步研究.CHD组间的PCSK9血清学水平在＜60岁的年龄段显著高于对照组，而≥60岁后无此现象，考虑到CHD是一种多因素、多基因性的疾病，高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟和肥胖以及一些不良的生活习惯［18］均是其主要致病因素，故该现象可能是PCSK9基因突变导致的CHD发病年龄较非遗传因素早所致.

由于CHD组三个月内因CHD复发入院的患者仅有2例，无法通过统计学比较PCSK9血清学水平对他汀类药物药物疗效的影响，故需要延长数据收集时间，得到较大容量的样本后再进行比较.

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【中图分类号】R541.4

【文献标识码】A

文章编号：2095⁃6894（2016）06⁃06⁃04

收稿日期：2016-05-07；接受日期：2016-05-21

基金项目：东莞市科技计划医疗卫生类科研一般项目（2014105101170）

作者简介：钟孟如.E⁃mai1：X024050@163.com

Study on the assosiation betWeen the level of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han people in Dongguan

ZHONG Meng⁃Ru，LIU Zhong⁃Min，WAN De⁃Sheng，LI Wei⁃Qi，MO Yu⁃Qian
Laboratory Medicine，Peop1e's Hospita1 of Dongguan，Dongguan 523059，China

【Abstract】AIM：To investigate the assosiation between the 1eve1 of serum PCSK9 and coronary heart disease of Han peop1e in Dongguan.METHODS：The serum samp1es of 60 patients with CHD and 60 peop1e without CHD（the contro1 group）admitted into Peop1e's Hospita1 of Dongguan from June 2014 to June 2015 were se1ected as objects of study.The serum PCSK9 1eve1 was measured by ELISA.The 1eve1s of TC、TG、HDL⁃C and LDL⁃C were measured by enzyme chemistry method.RESULTS：The 1eve1 of PCSK9 in CHD patients was higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.01）. The 1eve1s of TCH，TG and LDL⁃C in CHD patients were higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）；The corre1ation coefficient of PCSK9 and 1ipid 1eve1s in CHD patients were 0.458，0.460，0.429 respective1y （P＜0.05）；The serum PCSK9 1eve1 of fema1e in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.The serum PCSK9 1eve1 of the patients，who were younger than 60 years o1d in CHD group was significant1y higher than the contro1 group，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.CONCLUSION：The p1asma PCSK9 1eve1s can be used as a new serum marker of coronary heart disease，and the 1eve1 of PCSK9 is c1ose1y corre1ated with 1ipid 1eve1s，age and gender.

【KeyWords】p1asma PCSK9 1eve1s；coronary heart disease；1ipid 1eve1；age；gender.