泛素连接酶Cbl-b调控p38MAPK在胰岛素与硒协同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡中的作用

徐天娇，刘　勇，李　萍，胥晓丽，曾菊绒

(1. 西安医学院药理学与毒理学教研室，陕西 西安　710021；2. 延安大学咸阳医院老年病科，陕西 咸阳　712000)



泛素连接酶Cbl-b调控p38MAPK在胰岛素与硒协同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡中的作用

徐天娇1，刘勇2，李萍1，胥晓丽1，曾菊绒1

(1. 西安医学院药理学与毒理学教研室，陕西 西安710021；2. 延安大学咸阳医院老年病科，陕西 咸阳712000)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.027

目的初步探讨胰岛素和硒协同抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡的机制。方法SD大鼠50只，随机分为空白对照组(Control组)、糖尿病心肌病模型组(DCM组)、糖尿病心肌病+胰岛素组(DCM+In组)、糖尿病心肌病+硒组(DCM+Se组)、糖尿病心肌病+胰岛素+硒组(DCM+In+Se组)。TUNEL法观察心肌细胞凋亡；Western blot观察凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3和PARP剪切片段的变化，同时观察Cbl-b和p38MAPK表达变化；免疫沉淀法检测Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用。结果胰岛素与硒协同抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)；胰岛素联合硒协同，增加Cbl-b的表达，降低p38MAPK表达(P<0.01)；两药联合协同增加Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用(P<0.01)。结论胰岛素与硒通过调控Cbl-b，抑制p38MAPK而阻止Bax转位来协同抑制心肌细胞凋亡。

胰岛素；硒；糖尿病心肌病；凋亡；Cbl-b；p38 丝裂原活化蛋白激酶；Ku70

高血糖及其诱导的氧化应激可通过激活p38MAPK促使Ku70释放出与之结合的Bax，进而Bax从细胞质进入线粒体，同时激活凋亡程序中最后的执行者caspase-3，启动细胞的线粒体凋亡途径[1-2]。Cbl-b是糖尿病发生中的一个易感基因，文献报道，糖尿病脂肪组织中Cbl-b与p38MAPK具有相互作用且能负性调控p38MAPK的表达；在Cbl-b+/+的3T3-L1脂肪细胞中给予胰岛素刺激后，IRS-1磷酸化明显增加，而Cbl-b-/-的3T3-L1脂肪细胞中IRS-1磷酸化未见明显增加[3-4]，这些说明Cbl-b与糖尿病的发生发展有着密切的关系。因此，DCM心肌细胞中上调Cbl-b表达和下调p38MAPK表达对DCM大鼠心功能的恢复是十分重要的。

众所周知，胰岛素能够快速有效的控制高血糖，但长期或大剂量使用会使疗效降低并引起明显的副作用(如胰岛素抵抗、低血糖、脂肪萎缩等)。硒作为哺乳动物必需的微量元素之一，具有抗氧化和类胰岛素样作用，并能够增强外周组织对胰岛素的敏感性，但硒的安全摄入量范围较窄，剂量过低降糖效果不明显，甚至没有降糖作用，过高又可导致慢性中毒症状。因此，将胰岛素和硒联合可以避免了大剂量单独使用胰岛素或硒所引起的不良反应。另外，与能够增加c-Cbl的表达一样，胰岛素也能够明显提高Cbl-b的水平[5-6]。本研究旨在观察胰岛素联合硒对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响，同时检测Cbl-b、p38MAPK、Bcl-2、PARP剪切片段、caspase-3的表达以及Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用，初步探讨胰岛素与硒协同抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡的机制。

1　材料与方法

1.1药物与试剂链脲佐菌素(STZ)和亚硒酸钠购于Sigma公司，中效胰岛素由丹麦诺和灵公司生产；anti-Bcl-2、anti-Cbl-b、anti-p38MAPK、anti-Ku70和Protein A/G beads、β-actin等均购自美国Santa Cruz公司，anti-COX4抗购于美国Gene Tex公司。

1.2方法

1.2.1动物模型制备及分组选取体质量180～230 g的SD大鼠，♀♂各半，分笼饲养，适应性喂养1周。用STZ 55 mg·kg-1一次性腹腔注射，1周后取尾静脉血测随机血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖～作为入选标准。原饲料继续喂养6周，经超声检测确定造模成功。

将大鼠随机分为5组，每组10只。Control组：自由进水和饮食；DCM组：自由进水和饮食； DCM+In组：按1U·kg-1·d-1皮下注射胰岛素；DCM+Se组：按180 μg·kg-1·d-1管饲亚硒酸钠； DCM+In+Se组：按1U kg-1·d-1皮下注射胰岛素，同时管饲180 μg kg-1·d-1亚硒酸钠；每组均连续给药6周。

1.2.2TUNEL检测细胞凋亡心肌组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。切片在二甲苯中脱蜡5～10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10 min。无水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min。滴加适量不含DNase的蛋白酶K，37℃作用20 min，PBS 洗涤3次。滴加TUNEL反应混合液于湿盒中，37℃反应1 h，PBS洗3次×3 min；擦去切片多余的液体，加适量DAB 溶液至切片上，室温下放置5 min，除去DAB液体，蒸馏水洗3次。苏木精复染，1%盐酸酒精分化，蒸馏水返蓝10 min。逐级乙醇脱水，透明，中性树脂封片。在光镜下观察，以细胞核呈棕黄色为凋亡阳性细胞。在显微镜下(×400倍)计数凋亡细胞和总细胞数，并计数凋亡指数(apoptosis index，AI)/%=凋亡细胞/总细胞数×100%。

1.2.3Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3、PARP剪切片段的表达以及心肌组织中Cbl-b和p38MAPK的表达将冷冻的心肌剪成碎块，加入适量RIPA蛋白提取液匀浆器匀浆，冰浴上操作；提取蛋白，BCA测定蛋白浓度，确定每孔上样蛋白量相等。取各组样品50 μg蛋白质，进行SDS-PAGE分离蛋白，并将蛋白电转移至PVDF膜上，再用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h；加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1 h，充分洗涤后与ECL反应，即刻用X光片曝光，目的条带使用分析仪进行分析。

1.2.4免疫沉淀检测Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用取经提取的总蛋白300 μg加入1.5 mL预先放置了裂解液的离心管，加入5 μg的IP抗体， 4℃孵育2 h；加入30 μL Protein A/G beads，4℃翻转1 h；4℃离心5 min，弃去上清液；Protein A/G beads用裂解液洗3～4次，每次1 mL，离心同上；加入15 μL 2×电泳上样缓冲液，煮3～5 min。离心，取上清液；将上清液50 μg，进行SDS-PAGE分离蛋白。并将蛋白电转移至PVDF膜上。再用含5%脱脂奶粉的TBS封闭1 h；加适当稀释的一抗后于4℃条件下孵育过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1 h，充分洗涤后与ECL反应，即刻用X光片曝光。

2　结果

2.1胰岛素联合硒协同抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡TUNEL法检测凋亡心肌细胞核呈棕黄色染色，Control组大鼠心肌细胞核极少有棕黄染色(AI约为5%)；DCM组大鼠心肌细胞中出现大量棕黄染色(AI为 30%～40%)，与Control组差异存在显著性(P<0.01)； DCM+In组(AI约为24%左右)、DCM+Se组(AI约为28%左右)和DCM+In+Se组(AI约为15%左右)心肌细胞棕黄色颗粒均明显减少，与DCM组差异具有显著性(P<0.05)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组心肌细胞中棕黄色染色明显减少(P<0.01)(Fig 1)。

2.2胰岛素联合硒对凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3、PARP剪切片段表达的影响Western blot结果显示，与Control组比较，DCM组心肌细胞中Bcl-2表达明显降低，caspase-3、PARP剪切片段表达明显升高(P<0.01)；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组心肌细胞中Bcl-2明显增加，同时caspase-3、PARP剪切片段明显减少(P<0.01)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组心肌细胞中Bcl-2表达明显上升，同时caspase-3、PARP剪切片段表达明显降低(P<0.01)(Fig 2)。以上结果说明，胰岛素和硒能够协同抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡。

Fig 1　TUNEL analysis of apoptosis in different groups(×400) A：Control；B：DCM；C：DCM+In；D：DCM+Se；E：DCM+In+Se

Fig 2　Levels of Bcl-2, caspase-3 and PARP in different groups

**P<0.01vscontrol；△P<0.05，△△P<0.01vsDCM；▲▲P<0.01vsDCM+In；##P<0.01vsDCM+Se

2.3胰岛素联合硒对DCM大鼠心肌组织中Cbl-b和p38MAPK表达的影响Western blot结果显示，与Control组比较，DCM组Cbl-b表达明显降低，而p38MAPK表达明显升高(P<0.01)；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组心肌细胞中Cbl-b表达明显增加，同时，p38MAPK表达明显减少(P<0.01)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组心肌细胞中Cbl-b表达明显上升，同时，p38MAPK表达明显减少(P<0.01)(Fig 3)。以上结果说明，胰岛素和硒能够协同增加心肌组织中Cbl-b的表达，并且协同降低p38MAPK的表达。

Fig 3　Levels of Cbl-b and p38MAPK in different groups

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsDCM；▲▲P<0.01vsDCM+In；##P<0.01vsDCM+Se

2.4胰岛素与硒对Cbl-b与p38MAPK之间相互作用的影响结果显示，与Control组比较，DCM组Cbl-b与p38MAPK之间相互作用明显减弱；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组心肌细胞中Cbl-b与p38MAPK之间相互作用明显增强；与DCM+In组和DCM+ Se比较，DCM+In+Se组心肌细胞中Cbl-b与p38MAPK之间相互作用明显增强(Fig 4)。

Fig 4　Cbl-b-p38MAPK interaction in control, DCM and DCM treated with insulin, selenium, combined dose of insulin and selenium

2.5胰岛素与硒对Ku70与Bax之间相互作用的影响结果显示，与Control组比较，DCM组Ku70与Bax之间相互作用明显减弱；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组心肌细胞中Ku70与Bax之间相互作用明显增强；与DCM+In组和DCM+ Se比较，DCM+In+Se组心肌细胞中Ku70与Bax之间相互作用明显增强(Fig 5)。

Fig 5　Ku70-Bax interaction in different groups

3　讨论

心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病变的一个重要特点，当心肌细胞凋亡达到一定数量时，就会导致心脏组织结构和心肌功能发生改变[8-9]。因此，早期使用能够降低血糖同时改善氧化应激水平的药物对于减少心肌细胞凋亡、改善心室重构及心功能不全具有十分重要的意义。

硒作为哺乳动物和人类必需的微量元素，具有抗氧化和类胰岛素样作用。并且我们前期研究已经证明：① 胰岛素和硒具有联合应用的切实可行性，并确定了胰岛素和硒联合的合理配比剂量(1 U·kg-1·d-1∶180 μg·kg-1·d-1)；② 胰岛素和硒联合应用在降低血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)以及血脂方面具有协同作用；③ 胰岛素和硒联合能够明显改善糖尿病心肌病大鼠心肌胶原网络重构，并减少心肌胶原纤维堆积。基于上述原因，我们提出将胰岛素和硒联合用于DCM。

本实验首先观察胰岛素和硒对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响。结果显示，胰岛素与硒联合明显抑制心肌细胞凋亡，增加Bcl-2表达，减少PARP剪切片段和caspase-3表达；两药联合应用在抑制细胞凋亡方面明显优于单用胰岛素或单用硒治疗。

p38信号途径是MAPK家族中的重要组成部分之一，在调节细胞凋亡、心肌肥厚等方面起重要作用。研究发现，在糖尿病心肌组织中，p38MAPK活性明显增高，并且伴随着心肌细胞凋亡增加[10-11]；p38MAPK能够激活其下游的转录激活蛋白环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)，而CREB的结合蛋白CBP具有内源性组蛋白乙酰基转移酶活性，能够直接引起组蛋白乙酰化(如Ku70乙酰化)[12]， Ku70被乙酰化后释放出结合的Bax，促进Bax从细胞质进入线粒体转位，启动线粒体凋亡途径。因此，下调p38MAPK对于抑制心肌细胞凋亡及心肌重塑具有十分重要的意义[13]。

泛素连接酶Cbl(casitas B-lineage lymphoma，Cbl)是一类分布广泛、拥有E3泛素连接酶活性的胞内信号接头蛋白，可以通过其不同的结构域与其它蛋白质分子结合，参与多种细胞信号转导的过程。Cbl-b是Cbl家族主要成员之一，在多种细胞中其可通过负性调控p38MAPK影响细胞凋亡[14-15]。据此，进一步观察胰岛素与硒联合对上述分子的影响有可能获得更大的DCM防治益处。实验结果表明，DCM组心肌组织中Cbl-b表达明显减少，p38MAPK明显升高，Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax相互作用均明显减弱，单用胰岛素治疗仅能部分增加Cbl-b表达，减少p38MAPK的表达，增加Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax相互作用，胰岛素联合硒能够明显增加Cbl-b表达，减少p38MAPK的表达，并明显增加Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用，这些说明胰岛素联合硒在上调Cbl-b表达，下调p38MAPK，以及增加Cbl-b与p38MAPK、Ku70与Bax之间的相互作用是最有效的。

综上所述，本研究结果表明，胰岛素联合硒协同抑制心肌细胞凋亡可能是通过上调Cbl-b，抑制p38MAPK激活而阻止Bax转位来实现的。

(致谢：本研究在西安医学院基础部基础医学研究所完成。)

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Role of ubiquitin ligase Cbl-b-regulated p38MAPK in insulin and selenium synergistic anti-myocardial apoptosis in diabetic cardiomyopathy

XU Tian-jiao1, LIU Yong2, LI Ping1, XU Xiao-li1, ZENG Ju-rong1

(1.DeptofPharmacology,Xi′anMedicalUniversity,Xi′an710021，China；2.DeptofGeriatrics,XianyangHospitalofYananUniversity,XianyangShanxi712000,China)

AimTo explore the mechanism of insulin in combination with selenium preventing myocardial apoptosis in diabetic cardiomyopathy rats.MethodsSD rats(n=50) were randomly divided into five groups: control, diabetic cardiomyopathy(DCM), DCM with insulin treatment, DCM with selenium treatment, and DCM with insulin and selenium combination treatment. The cell apoptosis was observed by TUNEL. The levels of Bcl-2, caspase-3,PARP,Cbl-b and p38MAPK were examined by Western blot. The interactions of Cbl-b-p38MAPK and Ku70-Bax were detected by immunoprecipitation. ResultsInsulin in combination with selenium synergistically inhibited apoptosis，up-regulated Cbl-b，down-regulated p38MAPK expressions and increased the interactions of Cbl-b-p38MAPK and Ku70-Bax.ConclusionInsulin and selenium synergistically inhibit myocardial apoptosis by regulating Cbl-b-inhibited p38MAPK and preventing Bax translocation.

insulin；selenium；diabetic cardiomyopathy；apoptosis；Cbl-b；p38MAPK；Ku70

2016-03-10,

2016-04-15

陕西省教育厅自然科学项目(No 15JK1633)；西安医学院重点学科建设经费资助

徐天娇(1975-)，女，博士,副教授，研究方向：糖尿病及其发病机制,Tel:029-86177562,E-mail:xtj1118@163.com

A

1001-1978(2016)08-1170-05

R-332；R322.11；R329.25；R347.8；R542.2；R587.2；R916.3

网络出版时间：2016-7-19 10:43网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.054.html