蔗糖铁注射液细菌内毒素检测法研究

任　韡，李　欣（解放军总医院药品供应中心，北京 100853）



蔗糖铁注射液细菌内毒素检测法研究

任韡，李欣（解放军总医院药品供应中心，北京 100853）

目的：建立检查蔗糖铁注射液细菌内毒素的检测方法（凝胶法），以控制药物质量，减少临床热原反应的发生。方法：按《中国药典》2015年版（四部）收载的细菌内毒素检测方法及指导原则进行实验，系统观察蔗糖铁注射液对鲎试剂与细菌内毒素凝集反应的干扰，确定凝胶法检测细菌内毒素的不干扰浓度。结果：蔗糖铁注射液稀释20倍后对鲎试剂无干扰作用，对2个厂家的8批样品进行检查，结果均符合规定。结论：细菌内毒素检测方法（凝胶法）可用于蔗糖铁注射液的内毒素检查，结果准确、重现性好。

蔗糖铁注射液；细菌内毒素；鲎试剂；干扰试验

蔗糖铁注射液主要成分是蔗糖铁，其化学名为氢氧化铁蔗糖复合物，临床上用于口服铁剂效果不好而需要静脉铁剂治疗的患者。目前《中国药典》2015年版并未收录该品种，也尚无国家标准对其进行细菌内毒素检查。为此，笔者参考《中国药典》2015年版［1］进行试验，为建立该品种的细菌内毒素检查提供理论参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；202-2AB干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；微量移液器，所用刻度吸管、玻璃试管、吸管均按规定处理。

1.2试药

蔗糖铁注射液（规格为5 mL：100 mg，南京恒生制药有限公司，批号150107、150303、150601、150803；规格为5 mL：100 mg，山西普德药业有限公司，批号03121104、03140203、03140903、03150102）；细菌内毒素工作标准品（批号150601-200965，180 EU/支，中国药品生物制品检定所）；鲎试剂（批号1407241，规格：0.1 mL/支，灵敏度：0.25 EU·mL-1，湛江博康海洋生物有限公司；批号1403330、1205035、110114，规格：0.1 mL/支，灵敏度分别为：0.25、0.125、0.06 EU·mL-1，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET水，批号1405270，规格：2 mL/支）。

2　方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度复核试验

将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ四个浓度的内毒素标准溶液。按规定进行试验，结果表明鲎试剂（tachypleus amebocytelysate，TAL）灵敏度符合规定，可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度作为该批鲎试剂的灵敏度。结果详见表1（表中“+”表示TAL安瓿从恒温水浴锅中轻轻取出，缓缓倒转180°，所形成凝胶不变形，不滑脱；“-”表示未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，易变形并滑脱，“/”表示未做）。

表1　鲎试剂灵敏度复核结果Tab 1　Results of sensitivity check test of TAL

2.2内毒素限值的确定

供试品的细菌内毒素限值（L）按照L = K/M的公式确定，K为人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU·kg-1·h-1表示，蔗糖铁注射液的首选给药方式是滴注，注射剂K = 5.0 EU·kg-1·h-1，M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，以mg·kg-1·h-1表示，人均体质量按60 kg计算。注射时间不足1 h，按1 h计算。成年和老年人每次5 ～ 10 mL（100 ～ 200 mg铁），儿童每次每千克体质量0.15 mL，根据说明书中提示，滴注时1 mL本品最多只能稀释到20 mL，如临床需要，配成较高浓度药液，10 mL本品应至少30 min滴完，静脉注射每次最大注射量是10 mL，则M = 200 mg·（60 kg·h）-1，因此L = 1.5 EU·mg-1。

2.3最大有效稀释倍数的确定

按公式MVD = cL/λ计算，L = 1.5 EU·mg-1，c = 20 mg·mL-1，目前λ的最小值为0.03 EU·mL-1，则试验时蔗糖铁的MVD为1000。

2.4干扰预实验

用BET水将蔗糖铁注射液分别稀释10、20、40、320、640倍，作为供试品阴性对照系列（NPC）。用上述稀释液作为溶剂，溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，使得每个浓度的供试品溶液中都含有2 λ内毒素，作为供试品阳性对照系列（PPC）。每一稀释度做2管，另取2支鲎试剂，加入BET水作为阴性对照；取2支，加入2 λ浓度的细菌内毒素工作标准品作为阳性对照。结果见表2，蔗糖铁注射液稀释20倍或更大稀释倍数时，对两个厂家的鲎试剂无干扰作用。

2.5供试品干扰试验

取3批蔗糖铁注射液，用BET水稀释成1︰20的供试品溶液。用BET水和稀释后的供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ的系列溶液，用2批不同厂家的TAL进行试验，每一浓度平行做4管。同时做阴性对照和供试品对照，各2管。结果见表3，显示两个系列的内毒素溶液反应终点浓度均在0.5 λ ～ 2 λ之间，表明供试品稀释20倍不干扰实验，可依该方法进行细菌内毒素检查。

表2　干扰预实验结果Tab 2　Results of preliminary test of interference test

表3　供试品（1︰20）干扰试验结果Tab 3　Results of interference test of the samples （1︰20）

2.6样品细菌内毒素检查

取8批蔗糖铁注射液分别用BET水稀释成20倍，分别使用3个灵敏度的鲎试剂，按《中国药典》2015年版进行检查，结果详见表4，可见8批样品细菌内毒素检查均符合规定。

3　讨论

3.1试验稀释倍数的确定

依据蔗糖铁注射液说明书的规定，成年人和老年人每周用药2 ～ 3次，每次5 ～ 10 mL（100 ～ 200 mg铁），与0.9％氯化钠注射液混合使用，5 mL本品最多稀释到100 mL 0.9％氯化钠注射液中。临床上也常用此浓度给予患者，因此本试验选用20倍稀释，进行细菌内毒素检查的干扰试验和样品内毒素检查，结果表明当样品稀释20倍时对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用，方法学验证结果也符合细菌内毒素检查法有效性的规定。若供试品稀释倍数太大、内毒素含量太低、鲎试剂灵敏度不够，易造成假阴性结果，建议试验前一定要计算最大有效稀释倍数［2］。

3.2鲎试剂的选择

《中国药典》规定每批鲎试剂在用于试验前应复核灵敏度。鲎试剂在生产、销售、运输、贮藏、使用等过程中，易受到外界因素的影响，如温度、光线、时间等，使促凝活性降低。尤其是不同厂家或不同批号的鲎试剂，即使标示灵敏度相同，检测同一检品时，也可能出现不同结果［2］。因此本试验采用2个不同厂家的相同灵敏度的鲎试剂及同一个厂家的三个不同灵敏度的鲎试剂同时进行试验，以避免因鲎试剂造成的判断失误。

表4　细菌内毒素检查结果Tab 4　Results of bacterial endotoxin test

由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度（如0.5 EU·mL-1或0.25 EU·mL-1）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响［3］。

3.3样品的选择

关于蔗糖铁注射液细菌内毒素的研究工作，已有相关文献［4］报道，但是选用的试验样品为单一厂家生产的样品。笔者在本次试验中选用了2个厂家的样品进行对照试验，排除了在生产工艺方面的干扰，增加了试验的可信度。

3.4注意事项

细菌内毒素是由亲水性的多糖和疏水性的类脂结合构成的一种两性大分子物质，在极性溶媒和非极性溶媒中均能聚合形成微粒样多聚体。聚合状态的细菌内毒素不能与鲎试剂发生凝集反应，涡旋使其解聚变为细菌内毒素单体才能使鲎试剂发生凝集反应。因此，在配制内毒素标准溶液的试验过程中，每次取液前均涡旋30 s以保证所取内毒素量的准确性并防止假阴性试验结果的出现［5］。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入以避免气泡的产生。

细菌内毒素检查必须排除外源性内毒素干扰，因此试验所用的玻璃器皿等均应进行高温处理除去可能存在的外源性内毒素，先用自来水将其洗干净并烘干水分，然后用洗液浸泡4 h，再用自来水将残余的洗液洗净，最后用新鲜蒸馏水冲洗，置适宜的密闭金属容器中迅速置烤箱中。禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗，因为纯化水中存在的阴阳离子经250 ℃高温干烤不能完全被破坏，会发生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应［6］。

当细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、供试品的生产工艺或试验环境中发生任何可能影响试验结果的因素变化时，需重新进行干扰试验［7］。

综上，目前《中国药典》2015年版并未收录蔗糖铁注射液，也尚无国家标准对其进行细菌内毒素检查。采用传统的家兔法检查热原，成本高、时间长、影响因素多、灵敏度低。细菌内毒素检查法相比于家兔热原检查法，具有经济、快捷、灵敏和易于标准化的优点，因此受到了现代药品检验技术的青睐［8］。因此，开展蔗糖铁注射液内毒素检查法的研究有着重要的实际意义。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：154-157.

［2］ 刘恩思.药品细菌内毒素检查法实验体会［J］.中国现代药物应用，2014，8（17）：215-216.

［3］ 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范（2010年版）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：310-321.

［4］ 马建丽，陈新文，王明媚，等.细菌内毒素检测法用于蔗糖铁注射液检测的可行性研究［J］.中国药物应用与监测，2009，6 （3）：147-149.

［5］ 张丽平，吴诚，刘彬，等.三种冲洗剂细菌内毒素检查方法的建立［J］.中国医药导报，2014，11（19）：90-92，102.

［6］ 李婧，孙文霞.银杏内酯注射液细菌内毒素检查法的探讨［J］.西南民族大学学报，2014，40（5）：715-718.

［7］ 嵇海澄，王倜，王春玲，等.酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素检查方法验证［J］.中国医药科学，2014，4（21）：105-107.

［8］ 李逢春.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法的建立［J］.中国药房，2014，25（25）：2379-2380.

Study on bacterial endotoxin test of iron sucrose injection

REN Wei， LI Xin（Department of Pharmaceutical Care， PLA General Hospital， Beijing 100853， China）

Objective： To set up the bacterial endotoxin determination method of iron sucrose injection （the gel-clot method） for the quality control of the drug and prevention of pyrogen reaction in clinical practice. Methods： The experiment was performed according to the Chinese Pharmacopoeia 2015 edition （4）. A systematic study was carried out to investigate the interferences of iron sucrose injection with limulus reagent and agglutination reaction to bacterial endotoxin in order to detect the non-interference concentration of bacterial endotoxin. Results： There was no interference in the bacterial endotoxin test when iron sucrose injection was diluted 20-fold. The results of 8 batches of samples from 2 manufacturers complied with the requirements. Conclusion： The established method of endotoxin test was feasible， accurate and repeatable for iron sucrose injection.

Iron sucrose injection； Bacterial endotoxin； Tachypleus amebocyte lysate； Interference test

R917

A

1672 - 8157（2016）03 - 0148 - 03

解放军总医院临床科研扶持基金项目（2012FCCXYY-4008）

李欣，女，副主任药师，主要从事新药研发、医院药学工作。E-mail：doublelixin@126.com

任韡，女，药师，主要从事药物分析与药品质量控制工作。E-mail：yewell2013@126.com

（2015-10-28

2016-02-23）