HPLC法测定结核性胸膜炎患者胸腔积液中莫西沙星的浓度

邓　斐，金家贵，王蓝天，陈　章，雍小兰（.成都医学院，四川 成都 60500；.成都军区总医院临床药学科，四川 成都6008；.成都军区总医院感染呼吸科，四川 成都 6008）



·实验研究·

HPLC法测定结核性胸膜炎患者胸腔积液中莫西沙星的浓度

邓斐1，金家贵1，王蓝天2，陈章3，雍小兰2（1.成都医学院，四川 成都 610500；2.成都军区总医院临床药学科，四川 成都610083；3.成都军区总医院感染呼吸科，四川 成都 610083）

目的：建立测定结核性胸膜炎患者胸腔积液中莫西沙星浓度的方法。方法：利用高效液相色谱方法测定胸水中莫西沙星的浓度。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（含0.05％三氟醋酸，23︰77）；流速为1.0 mL·min-1；紫外检测波长为296 nm（0 ～ 2.5 min），256 nm（2.5 ～ 4.5 min），296 nm（4.5 ～ 8.0 min）；柱温：25 ℃；进样量：30 μL。结果：莫西沙星血药浓度在0.1 ～ 10.0 μg·mL-1范围内线性关系良好（r = 0.999 2），定量下限为0.1 μg·mL-1，低、中、高3个质量浓度的日内精密度RSD分别为2.76％、2.23％和2.00％，日间精密度RSD分别为5.88％、3.49％和3.60％，三者提取回收率及内标的提取回收率分别为53.00％、63.26％、65.42％和91.51％。结论：采用高效液相色谱法测定结核性胸膜炎患者胸水中的莫西沙星浓度简便、准确、重现性好。

HPLC；莫西沙星；结核性胸膜炎；胸水；药动学

莫西沙星是第四代喹诺酮类广谱抗菌药物，作为一种二线抗结核药物在临床上得到广泛应用［1-2］，其对G+、G-及厌氧菌都具有抗菌活性，适用于慢性支气管炎发作，社区获得性肺炎，鼻窦炎，皮肤及软组织等各种感染［3-4］。研究［5-8］发现莫西沙星联用一线抗结核药物能够缩短结核患者的治疗疗程。但是莫西沙星在结核性胸膜炎患者体内的药动学特征尚未可知，为此笔者建立了以HPLC法用于测定胸水中莫西沙星的浓度。

1　材料

1.1仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司），TurboVap LV型浓缩仪（美国 Caliper公司），台式离心机（美国Bio-Rad公司），多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司），- 80 ℃冰箱（中国海尔公司）。

1.2试剂

莫西沙星标准品（德国Bayer公司，纯度：96.8％，批号R-1004-01G）；氟康唑标准品［中国食品药品检定研究院，纯度：99.9％，批号：100314-200503（B）］；流动相：三氟乙酸、二氯甲烷、乙醚等均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（含0.05％三氟醋酸，23∶77）；检测波长：296 nm（0 ～ 2.5 min），256 nm（2.5 ～ 4.5 min），296 nm（4.5 ～ 8.0 min）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：30 μL。在此条件下，莫西沙星与内标氟康唑能完全分离，不受胸水内源性杂质的干扰。详见图 1。

图1　HPLC色谱图A - 空白胸水，B - 空白胸水+内标+ 4.0 μg·mL-1莫西沙星标准溶液，C - 给药后3 h胸水样品；1 - 内标（氟康唑），2 - 莫西沙星Fig 1　HPLC chromatograms A - blank hydrothorax， B - blank hydrothorax + internal standard solution + 4.0 μg·mL-1moxifoxacin， C - hydrothorax sample 3 h after medication； 1 - internal standard （fuconazole）， 2 - moxifoxacin

2.2溶液的配制

（1）莫西沙星标准溶液：准确称取盐酸莫西沙星对照品10.04 mg（相当于莫西沙星10.0 mg）于10 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得莫西沙星（1 mg·mL-1）储备液。（2）内标溶液：准确称取氟康唑对照品9.98 mg于10 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得内标（1 mg·mL-1）储备液，于4 ℃保存，备用。（3）萃取剂：乙醚-二氯甲烷（3∶2）。

2.3胸水样品的处理

将胸水样品4 mL置于5 mL EP管中，离心（3500 r·min-1，4 ℃，10 min）取上清液，分装至2 mL EP管中，密封，标记，- 80 ℃冻存待分析。分析前将胸水样品放置于室温自然解冻后取200 μL胸水置于10 mL试管中，加入200 μL 50％甲醇、100 μL相应浓度的莫西沙星标准溶液和100 μL氟康唑内标溶液混合，涡旋混合10 s后加入3 mL萃取剂（乙醚-二氯甲烷 = 3∶2），放入多管涡旋振荡器震荡5 min后离心（4 ℃，3500 r·min-1，10 min），然后用Turbo Vap LV型浓缩仪挥干（30 ℃水浴），再萃取1次，合并上清液，挥干。最后用100 μL 50％甲醇复溶，进样量30 μL。

2.4线性范围及定量下限

配制浓度相当于0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg·mL-1的莫西沙星胸水标准溶液，按“2.3”项下方法对一系列浓度的莫西沙星胸水样品进行处理，色谱检查的进样体积为30 μL，采用“2.1”项下方法对胸水样品进行逐一检测，记录含有不同浓度莫西沙星的峰面积（As）、内标的峰面积（Ai），以每次测定的莫西沙星的色谱峰的峰面积与内标物氟康唑的峰面积的比值（As/Ai）为纵坐标（y），以与各个峰面积相对应的莫西沙星的浓度为横坐标（x）建立莫西沙星的标准曲线，得回归方程为：y = 82.49 x - 1.203×10-2（r = 0.999 2），结果表明莫西沙星在0.1 ～ 10.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，取一系列浓度中的最低浓度0.1 μg·mL-1作为该分析方法的定量下限。定量下限的回收率和精密度RSD（n = 6）分别为97.87％和6.04％，符合规定的要求。

2.5精密度实验

配制低、中、高3种浓度（0.2、2.0、8.0 μg·mL-1）的莫西沙星胸水标准溶液，每种浓度的胸水样品为6份，按“2.3”项下方法进行操作。根据当日标准曲线计算日内精密度。采用同样的方法连续检测3 d，根据试验结果，计算含有不同浓度的莫西沙星的胸水样品日间精密度，结果显示，不同浓度的莫西沙星胸水样品的日内精密度RSD在2.00％ ～ 2.76％范围内，日间精密度RSD在3.60％ ～ 5.88％范围内，日内、日间精密度均符合相关要求，详见表1。

2.6回收率实验

配制低、中、高三种浓度（0.2、2.0、8.0 μg·mL-1）的莫西沙星胸水标准溶液，每种浓度的胸水样品为6份，按“2.3”项下方法进行操作，配制相应系列浓度的莫西沙星标准溶液并测定检测，将2组峰面积进行比较，计算莫西沙星的提取回收率，详见表1。结果显示三组回收率均符合要求。内标提取回收率为91.51％。

表1　精密度及回收率实验结果. n = 6Tab 1　Results of precision and recovery tests. n = 6

2.7生物样品稳定性考察

分别配制低、中、高三种浓度（0.2、2.0、8.0 μg·mL-1）的莫西沙星空白胸水6份，分别在室温、反复冻融、长期冻存后按“2.3”项下方法操作分析，测定结果见表2。结果显示莫西沙星的质量浓度均保持稳定，符合要求。

表2　稳定性实验结果. n = 6Tab 2　Results of stability tests. n = 6

2.8样品测定

1例结核性胸膜炎患者同时口服盐酸莫西沙星片400 mg和一线抗结核药物（服用剂量遵医嘱），在0、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、 6、8、12、24 h时采集胸水4 mL（经临床医生行胸腔闭式引流术后放置引流管，从引流管中取出），按“2.3”项下方法处理后进样测定，详见图2。

3　讨论

莫西沙星联用一线抗结核药物是临床上常用的治疗结核的诊疗方案［3］，建立莫西沙星在结核性胸膜炎胸水中的方法学有助于测定莫西沙星在结核性胸膜炎患者胸水中的浓度，为临床医生合理应用莫西沙星治疗结核性胸膜炎提供理论依据。前期本课题组已建立了利用HPLC法测定结核性胸膜炎患者血浆中莫西沙星浓度的方法学［9］。其他测定胸水中药物浓度的方法存在方法繁琐，差异大，费用高昂等问题，故本次试验我们建立了以HPLC法测定胸水中莫西沙星浓度的方法，该测定方法准确、灵敏、重现性好，具有如下特点：（1）内标物采用氟康唑。氟康唑分离效果好、无干扰，是莫西沙星较为理想的内标物。（2）本试验所用色谱柱的固定相是Agilent Eclipse XDB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），由于莫西沙星分子中含有-NH2、-COOH等，易与硅-OH结合，从而导致拖尾峰的产生，导致峰形不尖锐，分离度下降。所以我们在流动相纯化水中加入0.05％三氟乙酸，减少了拖尾峰的产生，同时调节了莫西沙星色谱峰的峰形和提高其检测灵敏度。（3）由于胸水其本身的性质，蛋白等物质含量与血浆相比要高，干扰大［10］，故本研究采用增加萃取次数来减少蛋白等其他物质的干扰。萃取剂采用乙醚-二氯甲烷（3︰2），该萃取剂易得、方便和高效、沉淀能力强，是作为利用HPLC法前处理血浆最常用的萃取剂［11］。（4）参考莫西沙星在类肺炎性胸腔积液中谷浓度（0.99±0.84） µg·mL-1，峰浓度（2.96±1.45） µg·mL-1［12］，本试验所选莫西沙星在胸水中的浓度最低下限0.1 µg·mL-1和上限10.0 µg·mL-1均符合要求。本次实验证明利用HPLC法检测莫西沙星浓度，准确度、灵敏度高，均符合实验要求。有助于我们下一步研究莫西沙星在结核性胸膜炎患者胸水中的药动学。

图2　药-时曲线趋势图Fig 2　Tendency chart of concentration-time curves

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Determination of moxifloxacin concentration in pleural effusion of tuberculous pleurisy patients by HPLC

DENG Fei1， JIN Jia-gui1， WANG Lan-tian2， CHEN Zhang3， YONG Xiao-lan2（1. Chengdu Medical College， Chengdu 610500，China； 2. Department of Clinical Pharmacy， General Hospital of Chengdu Military Command， Chengdu 610083， China； 3. Department of Infection Control and Respiration， General Hospital of Chengdu Military Command， Chengdu 610083， China）

Objective： To establish a method for the determination of moxifoxacin concentration in pleural effusion of tuberculous pleurisy patients. Methods： We used high performance liquid chromatography （HPLC） to determine moxifloxacin concentration in pleural effusion of tuberculous pleurisy patients. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （0.05％ trifuoroacetic acid， 23︰77） at the fow rate of 1.0 mL·min-1. UV detection wavelengths were set at 296 nm （0 - 2.5 min）， 256 nm （2.5 - 4.5 min） and 296 nm （4.5 - 8.0 min）， respectively. The column temperature was 25 ℃ and injection volume was 30 μL. Results： In the range of 0.1 - 10.0 μg·mL-1（r = 0.999 2）， moxifoxacin showed a good linear relation. The lower limit of quantitation was 0.1 μg·mL-1. The inter-day precision RSD of low， medium and high concentration were 2.76％， 2.23％ and 2.00％， and intra-day precision RSD were 5.88％， 3.49％ and 3.60％， respectively. The extraction recovery of them were 53.00％， 63.26％ and 65.42％， and internal standard was 91.51％， respectively. Conclusion： The measuring method adopted in the experiment can accurately determine the concentration of moxifloxacin in pleural effusion of tuberculous pleurisy patients with convenience， high sensitivity and exceptional reproducibility.

High performance liquid chromatography （HPLC）； Moxifloxacin； Tuberculous pleurisy； Pleural effusion；Pharmacokinetics

R917

A

1672 - 8157（2016）03 - 0140 - 04

四川省科技厅基金项目（42412D1Y）

雍小兰，女，主任药师，主要从事临床药学工作。E-mail：yongxlan@126.com

邓斐，女，硕士研究生，研究方向：临床治疗药物监测。E-mail：lv99dengfei@163.com

（2015-11-06

2016-02-19）