Gli抑制剂GANT61对肺癌细胞上皮-间质转化作用的研究

王　雷，杜媛鲲，王　娜

(1.河北医科大学第四医院胸二科，石家庄 050011；2.河北医科大学期刊社，石家庄 050017；3.河北医科大学第四医院河北省肿瘤研究所分子生物室，石家庄 050011)



Gli抑制剂GANT61对肺癌细胞上皮-间质转化作用的研究

王雷1，杜媛鲲2，王娜3

(1.河北医科大学第四医院胸二科，石家庄 050011；2.河北医科大学期刊社，石家庄 050017；3.河北医科大学第四医院河北省肿瘤研究所分子生物室，石家庄 050011)

目的研究GANT61对人肺癌细胞H1703和A549的上皮-间质转化(EMT)的影响，并初步探讨其作用机制。方法以二甲基亚砜(DMSO)作为对照(DMSO组)，用GANT61处理H1703和A549细胞24 h后，采用实时荧光定量PCR法检测Gli-1、Gli-2、E-cadherin和Vimentin基因变化；蛋白质印迹法(Western blotting)观察GANT61作用于H1703和A549细胞后对E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响，划痕愈合实验观察GANT61作用于H1703和A549细胞后对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果与DMSO组比较，实时荧光定量PCR结果显示GANT61可下调H1703和A549细胞Gli-1、Gli-2及Vimentin mRNA的表达，升高E-cadherin mRNA的表达(P<0.01)；Western blotting显示，GANT61可以下调H1703和A549细胞Vimentin蛋白表达，升高E-cadherin蛋白表达(P<0.01)；划痕愈合实验显示，GANT61处理组H1703和A549细胞的侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论肺癌的EMT与Hedgehog信号转导通路中Gli-1和Gli-2的异常激活有关，GANT61通过下调Gli-1和Gli-2的表达影响肺癌细胞的EMT能力，Gli可能成为抑制肺癌细胞转移的新的分子靶点。

肺癌；Hedgehog信号通路；GANT61；Gli蛋白；上皮-间质转化

每年全球肺癌发病率和病死率高居各种恶性肿瘤之首，肺癌是我国增长速度最快的恶性肿瘤之一。肺癌病理学分型主要为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中鳞癌和腺癌为最常见的非小细胞肺癌类型，患者确诊时多为中晚期，传统放疗、化疗效果欠佳。近年来如酪胺酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)等靶向治疗已经使部分腺癌患者受益，但多数非小细胞肺癌患者仍然没有找到更合适的治疗靶点。近年来研究发现，异常活化Hedgehog(Hh)信号通路在多种肿瘤的发生、发展中起着关键作用[1-5]。经典的Hh信号传导通路主要包括Hh配体、Patched受体、Smoothened蛋白、核转录因子Gli及下游目的基因[6]。GANT61是近年研制的特异性针对Gli靶点的Hh通路抑制剂，具有较好的抗肿瘤活性。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，这种过程使上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力，并且与肿瘤的复发和转移密切相关[7]。目前，关于Hh通路与肺癌EMT关系的研究较少，本研究通过探讨GANT61特异性阻断人肺癌细胞系H1703和A549中Gli-1和Gli-2的表达，观察其对肺癌细胞EMT的影响，初步探讨Hh通路与肺癌EMT的关系，以及GANT61的作用机制，为肺癌靶向治疗提供新思路。

1　材料与方法

1.1细胞来源人肺鳞癌细胞系H1703和腺癌细胞系A549，由河北医科大学第四医院河北省肿瘤研究所分子生物室提供。

1.2仪器与试剂GANT61(美国Selleckchem公司)，Gli-1引物和探针(Hs00171790，美国Life technologies公司)，Gli-2引物和探针(Hs01119974_m1，美国Life technologies公司)，E- cadherin 引物和探针(Hs01023894_m1，美国Life technologies公司)，Vimentin引物和探针(Hs00257977_m1，美国Life technologies公司)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物和探针(Hs02758991_g1，美国Life technologies公司)，上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)鼠抗人单克隆抗体(ab1416，美国Abcam公司)，波形蛋白(Vimentin)兔抗人单克隆抗体(ab92547，美国Abcam公司)，GAPDH鼠抗人单克隆抗体(sc32233，美国Santa Cruz公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒(美国Thermo Scientific公司)，M-PER培养细胞总蛋白提取试剂(美国Thermo Scientific公司)，蛋白酶抑制剂(德国roche公司)，cDNA合成试剂盒(美国Bio-Rad公司)，总RNA提取试剂盒(德国 Qiagen公司)，Taqman 基因表达预混液(美国应用生物系统公司)，Mini-PROTEAN TGX 预制胶(美国Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸/电泳缓冲液(美国Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸缓冲液(美国Bio-Rad公司)，SuperSignal West Femto最高灵敏度底物(美国Thermo-Pierce公司)。NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，Veriti®96-Well Thermal Cycler(美国应用生物系统公司)，ABI 7900HT高通量荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养将人肺癌细胞系H1703和A549细胞培养于RPMI-1640培养液、10%胎牛血清、青链霉素各100 U/mL的培养基中，37 ℃ 5%CO2培养箱中孵育，取对数生长期细胞计数后接种到6孔和12孔板进行实验。

1.3.2实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)法于12孔板内呈70%～80%融合生长的H1703和A549细胞中加入浓度为10 μmol/L的GANT61，并同时更换无血清培养基，继续处理24 h，对照组为二甲基亚砜(DMSO)组。(1)24 h后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，每孔加总RNA提取试剂盒中提供的裂解缓冲液RLT 350 μL和70%无水乙醇350 μL；接着将裂解液上样到带有RNeasy硅胶膜的柱子中，12 000 r/min离心15 s后倒掉废液，加入去蛋白液RW1 700 μL 12 000 r/min离心15 s倒掉废液，再加入缓冲液RPE 500 μL有效洗涤去除其他各种污染物。最后将浓缩的纯RNA洗脱到无RNA酶的水中。(2)将经RNeasy技术纯化得到的RNA在NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计仪器中检测RNA浓度，采用美国Bio-Rad公司的反转录cDNA合成试剂盒(iScript cDNA Synthesis Kit)和Veriti®96-Well Thermal Cycler仪器进行cDNA的反转录，方法参照试剂盒说明书，反转录条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。(3)将cDNA稀释10倍后加 cDNA、Taqman基因表达预混液，以及Gli-1、Gli-2、E-cadherin、Vimentin和GAPDH引物和探针到384孔板进行实时荧光定量PCR检测，反应体系每孔10 μL(cDNA 4.5 μL，引物和探针0.5 μL，Taqman基因表达预混液5 μL)，PCR反应条件为95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。读取Ct值后采用2-△△Ct法进行数据分析。

1.3.3蛋白质印迹法(Western blotting)设对照组为DMSO，于6孔板内呈对数生长期的H1703和A549细胞加浓度为10 μmol/L的GANT61，并同时更换无血清培养基处理24 h，用PBS洗涤细胞后加细胞蛋白提取液和蛋白酶抑制剂，收集提取液后用BCA法测定蛋白浓度。于Mini-PROTEAN TGX预制胶中行蛋白上样，每泳道上样10 μg蛋白，在电泳槽中经Tris/甘氨酸/电泳缓冲液十二烷基硫酸钠(SDS)进行电泳后在Tris-甘氨酸缓冲液中将蛋白电转移印迹到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再用5%脱脂奶粉/含吐温20的Tris缓冲液(TBST)封闭PVDF膜1 h，E-cadherin工作浓度为1∶5 000、Vimentin工作浓度为1∶10 000，GAPDH工作液浓度为1∶10 000，4 ℃过夜，二抗工作浓度为1∶20 000孵育1 h后用TBST洗膜，再用SuperSignal West Femto最高灵敏度底物试剂发光后于暗室曝光显影。

1.3.4划痕愈合实验取对数生长期细胞接种于6孔板，置37 ℃细胞培养箱中过夜。第2天培养至细胞呈70%～80%融合时加入浓度为10 μmol/L的GANT61处理 24 h，对照组为DMSO组，分别在GANT61处理组和对照组的单细胞层上划痕，继续培养以使划痕愈合。于划痕后24 h每组取4个视野拍照，在倒置显微镜下观察细胞的划痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。闭合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.4统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1实时荧光定量PCR检测结果检测GANT61作用24 h对H1703和A549细胞Gli-1、Gli-2、E-cadherin及Vimentin基因的影响，结果表明：H1703细胞株中GANT61处理组Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表达水平低于对照组，E-cadherin mRNA表达水平较对照组上调，差异均有统计学意义(P值分别为0.003、0.001、0.004、0.001)；经GANT61处理的A549细胞Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表达水平低于对照组，E-cadherin mRNA的表达水平较对照组上调，差异均有统计学意义(P值分别为0.009、0.002、0.001、0.000)，见图1。

A、C：H1703细胞；B、D：A549细胞。*：P<0.01，与DMSO组比较。

图1实时荧光定量PCR检测结果

2.2Western blotting检测结果应用GANT61处理H1703后，E-cadherin蛋白表达高于对照组，Vimentin表达低于对照组，而内参GAPDH蛋白表达无明显变化；A549细胞处理组E-cadherin蛋白表达高于对照组，而Vimentin蛋白表达低于对照组，内参GAPDH蛋白表达无明显变化，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2、3。

*：P<0.01，与DMSO组比较。

图2Western bloting检测结果

2.3划痕愈合试验GANT61处理18 h后，H1703的侵袭能力明显受到抑制，闭合率为DMSO组的72%,与DMSO组相比，差异有统计学意义(P=0.000)。A549细胞GANT61处理组闭合率仅为DMSO组的45.4%，与DMSO组相比，差异有统计学意义(P=0.000)。见图4。

*：P<0.01，与DMSO组比较。

图3Western blottting检测结果

*：P<0.01，与DMSO组比较。

图4划痕愈合实验

3　讨　　论

经典的Hh通路包括两部分：(1)活化的Hh信号从质膜到胞内的过程,该过程涉及Smo的调控；(2)信号从胞内到核内的过程，该过程涉及转录因子家族Gli的调控。Gli蛋白家族包括3种形式：Gli-1、Gli-2和Gli-3。Gli-3被认为是转录抑制因子。Gli-1上调是Hh通路激活的重要标志，Gli-2是Hh信号调节的主要转录激活子，Gli-1和Gli-2在活化的Hh通路中起到承上启下的核心作用，可以促进靶基因的异常表达，从而造成细胞过度增殖并最终癌变和转移。Li等[8]在对间皮瘤的研究中发现，Gli靶点的抑制剂比针对Smo靶点的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，以及小分子药物维莫德吉(vismodegib)、环巴胺(cyclopamine)等具有更好的抗肿瘤效应，以Gli-1和Gli-2为靶点对Hh信号通路进行调控可以起到精确高效的作用。因此，本研究选择Gli特异性抑制剂GANT61进行抗肿瘤研究，结果显示GANT61可以明显下调H1703和A549细胞Gli-1、Gli-2基因的表达，表明肺癌细胞中存在Gli的异常激活，GANT61可以明显抑制Gli的表达。

EMT是近年来抗肿瘤领域的研究热点之一，EMT可以参与肿瘤的发生、发展，与肿瘤的侵袭转移及耐药等恶性生物学行为密切相关，其中E-cadherin是EMT特异性标记物之一，其表达水平降低可导致肿瘤细胞间黏附能力减低，迁移能力增强，从而导致肿瘤转移[9]。Vimentin是间质细胞的重要标记物之一，可使细胞黏着斑的空间结构发生改变而影响肿瘤细胞的黏附与迁移能力，抑制Vimentin的表达可以减弱肿瘤细胞黏附、迁移能力[10]。本研究显示，应用GANT61处理肺癌细胞24 h后可以下调Vimentin mRNA和蛋白表达，上调E-cadherin mRNA和蛋白表达。分析其原因可能是Gli-1和Gli-2作为Hh信号调节的主要转录激活子，可将异常激活的Hh/Gli信号传导至细胞核内对多种靶基因起转录激活作用。因为EMT的发生涉及多种信号转导通路参与其中，与诱导因子、转录因子及微环境等因素有关。有研究显示，转录因子Gli可以通过调控EMT促进癌细胞的侵袭转移[11-12]。本研究表明，GANT61可以通过靶向性抑制Gli-1和Gli-2的表达来上调E-cadherin，下调Vimentin，从而最终调控肺癌细胞的EMT进程。本研究的划痕实验也进一步证实了GANT61处理组肿瘤细胞的侵袭能力可以明显下降。

综上所述，由于过度活化的Hh信号通路在肺癌生长转移中起着关键作用，以及Gli在Hh信号传导通路中的核心作用，针对Gli靶点的治疗可能成为肺癌治疗的新策略之一。

[1]Bian XH，Sun H，Xue H，et al．Expression and clinical significance of Shh/Gli-1 in papillary thyroid carcinoma[J]．Tumour Biol，2014，35(10)：10523-10528．

[2]Chen JS，Li HS，Huang JQ，et al．Down-regulation of Gli-1 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration and invasion[J]．Mol Cell Biochem，2014，393(1/2)：283-291．

[3]Lei J，Fan L，Wei G，et al．Gli-1 is crucial for hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition and invasion of breast cancer[J]．Tumour Biol，2015，36(4)：3119-3126．

[4]Lei J，Ma J，Ma Q，et al．Hedgehog signaling regulates hypoxia induced epithelial to mesenchymal transition and invasion in pancreatic cancer cells via a ligand-independent manner[J]．Mol Cancer，2013(12)：66．

[5]Bermudez O，Hennen E，Koch I，et al．Gli1 mediates lung cancer cell proliferation and Sonic Hedgehog-dependent mesenchymal cell activation[J]．PLoS One，2013，8(5)：e63226．

[6]Bohinc B，Michelotti G，Diehl AM．Hedgehog signaling in human medullary thyroid carcinoma: a novel signaling pathway[J]．Thyroid，2013，23(9)：1119-1126．

[7]Yue D，Li H，Che J，et al．Hedgehog/Gli promotes epithelial-mesenchymal transition in lung squamous cell carcinomas[J]．J Exp Clin Cancer Res，2014，33(1)：34．

[8]Li H，Lui N，Cheng T，et al．Gli as a novel therapeutic target in malignant pleural mesothelioma[J]．PLoS One，2013，8(3)：e57346．

[9]Yilmaz M，Christofori G．Mechanisms of motility in metastasizing cells[J]．Mol Cancer Res，2010，8(5)：629-642．

[10]McInroy L，Mättä A.Down-regulation of vimentin expression inhibits carcinoma cell migration and adhesion[J]．Biochem Biophys Res Commun，2007，360(1)：109-114．

[11]Behnsawy HM，Shigemura K，Meligy FY，et al．Possible role of sonic hedgehog and epithelial-mesenchymal transition in renal cell cancer progression[J]．Korean J Urol，2013，54(8)：547-554．

[12]Wang ZS，Shen Y，Li X，et al．Significance and prognostic value of Gli-1 and Snail/E-cadherin expression in progressive gastric cancer[J]．Tumour Biol，2014，35(2)：1357-1363．

Study on role of GANT-61 as Gli inhibitor on epithelial-mesenchymal transition of lung cancer

WangLei1，DuYuankun2，WangNa3

(1.SecondDepartmentofThoracicSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China；2.JournalPress,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050017,China；3.DivisionofMolecularBiology,HebeiProvincialCancerInstitute,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

ObjectiveTo research the effect of GANT61 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human lung cancer H1703 and A549 cells lines,and to preliminarily investigate its action mechanism．MethodsDMSO was used as the control(DMSO group).After treating H1703 and A549 cells with GANT61 for 24 h,the gene changes of Gli-1,Gli-2,E-cadherin and Vimentin were detected by using the real time fluorescence quantitative PCR method.The influence of GANT61 on the expression of E-cadherin and Vimentin protein after acting on H1703 and A549 cells was observed by using the Western blotting assay.The scratch healing test was performed to evaluate the effect of GANT61 on the tumor cell invasion ability after acting on H1703 and A549 cells.ResultsThe real time fluorescence quantitative PCR showed that,compared with the DMSO group,GANT61 down-regulated the mRNA expression of Gli-1,Gli-2 and Vimentin mRNA of H1703 and A549 cell lines and elevated the expression of E-cadherin protein(P<0.01);the Western blotting showed that GANT61 down-regulated the expression of Vimentin of H1703 and A549 cell lines, and elevated the expression of E-cadherin(P<0.01)；the scratch healing test revealed the invasion ability of H1703 and A549 cells in the GANT61 treatment group was significantly decreased (P<0.01).ConclusionEMT in lung cancer is related with aberrant activations of Gli1 and Gli2 in Hedgehog signal transduction pathway,GANT61 could influence the EMT ability in lung cancer cells by down-regulating the expression of Gli-1 and Gli-2.Gli could become a new molecular target for inhibiting the lung cancer cell metastasis

lung cancer; Hedgehog signaling pathway; GANT61; Gli protein; epithelial-mesenchymal transition

王雷(1976-)，副教授，博士后，主要从事胸部肿瘤的靶向治疗研究。

R734.2

A

1671-8348(2016)21-2903-03

2016-01-23

2016-04-10)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.007