葡萄籽原花青素及UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响

史先花，张峻岭，康元（.山东省济宁市第一人民医院，济宁 7000；.天津中医药研究院附属医院，天津 000；.天津中医药大学第一附属医院，天津 009）

葡萄籽原花青素及UVA照射对HaCaT细胞增殖活性的影响

史先花1，张峻岭2，康元3
（1.山东省济宁市第一人民医院，济宁 272000；2.天津中医药研究院附属医院，天津 300120；3.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

目的观察葡萄籽原花青素（GSPE）和长波紫外线（UVA）对人角质形成细胞（HaCaT细胞）增殖的影响，以探讨GSPE有无光保护作用。方法MTT法分别测定不同浓度GSPE以及不同剂量UVA对HaCaT细胞增殖活性的影响。结果 GSPE浓度为5～200 μg/mL时，对HaCaT细胞增殖影响不明显，浓度为500 μg/mL及以上时抑制细胞生长，且有统计学意义；UVA剂量超过10 J/cm2有抑制作用且随剂量增高抑制作用越明显，且有统计学意义，25 J/cm2时其抑制率达37.65%；浓度为50、100 μg/mL的GSPE对25 J/cm2UVA照射后的HaCaT细胞的增殖有明显促进作用。结论25 J/cm2的UVA对HaCaT细胞的增殖有明显抑制作用，而合适浓度的GSPE对HaCaT细胞增殖活性有光保护作用。

葡萄籽原花青素；长波紫外线；人角质形成细胞

1　材料与方法

1.1实验材料DMEM高糖液态培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、D-Hank's液和MTT细胞增殖及细胞毒性检验试剂盒，GSPE为天津市尖峰天然产物研究开发有限公司赠送。

1.2细胞培养与UVA照射将HaCaT细胞以密度为105/mL接种于25 cm2培养瓶培养和传代，当细胞对数生长期、密度近1×106/mL（融合度近80%）时进行实验。光源为UVA光疗仪SS-03A，波长320～400 nm。光源至细胞的照射距离为15 cm。

1.3不同浓度GSPE的配制称取一定量的GSPE融于二甲基亚砜溶液（DMSO）中制成50 mg/mL的母液，-20℃保存，临用时用新鲜培养基调至终浓度。1.4实验分组实验设调零孔（MTT液+DMSO）即空白对照组，光照组（5，8，10，15，20，25，30，40 J/cm2），药物组（5、10、25、50、75、100、200、500 μg/mL），照光25 J/cm2加药（10，50，100 μg/mL）组。每个剂量或浓度设5个复孔，实验重复3次。

1.5MTT法测定细胞增殖活性取对数生长期的HaCaT细胞消化，计数，将细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为4×103/孔，液体量200 μL/孔，过夜，待细胞贴壁，吸去培养液，用D-Hank's液冲洗、换液，对细胞分别进行不同剂量紫外线照射、不同浓度GSPE处理，添加培养基后继续培养24 h，对照组不照光仅加入含等量溶媒的培养基。处理结束时，每孔加5 g/L MTT 20 μL，继续置CO2孵箱培养4 h，然后吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，充分振摇培养板，用酶标仪测定每孔吸光度A490 nm值。

1.6统计学分析所有数据用SPSS17.0进行统计，符合正态分布以±s表示，多个样本均数比较用单因素方差分析，其中两两间比较用LSD法比较，显著性检验水准α=0.05。

2　实验结果

2.1不同剂量UVA对HaCaT细胞增殖活性的影响UVA剂量高于10 J/cm2时对HaCaT细胞的增殖有明显的抑制作用，且各组均有统计学意义（P＜0.05）。25 J/cm2时其抑制率达37.65%，见表1。

表1不同剂量UVA对HaCaT细胞增殖活性的影响

2.2不同浓度GSPE对HaCaT细胞增殖活性的影响GSPE浓度为5～200 μg/mL时，对HaCaT细胞增殖作用不明显，浓度为500 μg/mL时抑制细胞生长，有统计学意义（P=0.00），见表2。

2.3不同浓度GSPE（μg/mL）对25 J/cm2UVA照射HaCaT细胞增殖活性的影响GSPE为50、100μg/mL时对UVA照射后的HaCaT细胞增殖有促进作用，且有统计学意义（P=0.00），见表3。

表2 不同浓度GSPE对细胞增殖活性的影响

表3　不同浓度GSPE（μg/mL）对25 J/cm2UVA照射HaCaT细胞增殖活性的影响

3　讨论

日光中的紫外线（Utltraviolet，UV）分为3个波段，导致皮肤损伤的主要是UVA和UVB。过多的接触紫外线可造成皮肤的氧化损伤，进而引起光老化、皮肤癌变、免疫抑制等相关疾病的发生。紫外线作用的靶点主要是角质细胞、黑素细胞和成纤维细胞，这三种细胞也对其具有阻挡、吸收的作用。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，占表皮细胞的90%，而照射到皮肤的紫外线95%被其吸收。人角质形成细胞株（HaCaT细胞）保留了表皮细胞的大部分分化能力，因此与正常人角质形成细胞在生物学特性上极为相似。以往的研究多集中在UVB对其增殖代谢的影响方面，UVA对其增殖活性的影响少有报道，且结果大相径庭。有报道5～10 J/cm2UVA照射HaCaT细胞即可出现光损伤［1-3］；也有报道生理剂量－普通日照约2 h（25 J/cm2UVA）照射，对角质形成细胞的细胞膜无明显的损伤作用［4］，还有用30J/ cm2UVA照射HaCaT细胞作为光损伤模型的［5］。本实验研究中，当UVA的剂量低于10 J/cm2时，可轻度促进HaCaT细胞增殖，具体机制不明，推测可能为轻度代偿性增殖或者温度等其他因素所致。足以抑制HaCaT细胞增殖、造成明显光损伤的UVA剂量为25 J/cm2，据此也可说明长期慢性生理剂量的紫外线照射可以抑制HaCaT细胞正常增殖，使皮肤对紫外线的防御减弱而导致皮肤光损伤的发生。

葡萄籽提取物原花青素是迄今为止人类所发现的最强最有效的自由基清除剂之一，尤其是其体内活性，是其他抗氧化剂不可比拟的，国内有实验证明外用GSPE对急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡具有防护作用［6］，但对HaCaT细胞增殖活性的影响尚未见报道。本研究显示当GSPE浓度小于200 μg/mL时，对HaCaT细胞增殖作用不明显，浓度为500 μg/mL时可抑制其生长，证明了GSPE安全范围大。同时当GSPE为50～100 μg/mL时可以促使UVA照射后逐渐减少的HaCaT细胞再生，且可使其逐渐趋于正常。由此可见，GPSE是一种可靠的具有光保护作用的植物成分。

本研究发现25 J/cm2的UVA对HaCaT细胞的增殖有明显抑制作用，而浓度为50～100 μg/mL的 GSPE有一定的光保护作用。这也为日后以HaCaT细胞为模型进行皮肤光损伤的研究提供了理论依据。

［1］ 陈明亮，李吉，肖伟荣，等.白藜芦醇对UVA致HaCaT细胞氧化损伤的保护作用［J］.中南大学学报，2006，31（5）：635-639.

［2］李立，白雪涛，张宏伟，等.长波紫外线照射对HaCaT细胞氧化损伤作用的研究［J］.环境与健康杂志，2010，27（3）：230-232.

［3］李敏，骆丹，林向飞.表没食子儿茶素没食子酸酯抑制长波紫外线诱导的HaCaT细胞氧化损伤和凋亡［J］.临床皮肤科杂志，2008，37（2）：80-83.

［4］Applegate LA，Noel A，Vile G，et al.Two genes contribute to different extents to the heme oxygenase enzyme activity measured in cultured human skin fibroblasts and keratinocytes：Implications for protection against oxidant stress［J］.Photochem Photobiol，1995，61：285-291.

［5］李建民，徐艳明，陈巧云，等.杜仲对UVA致HaCaT细胞光老化保护作用的实验研究［J］.中国美容医学，2010，19（9）：1316-1318.

［6］袁小英，刘玮，谢艳飞，等.葡萄籽提取物原花青素对皮肤急性光损伤Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的影响［J］.中国美容医学，2008，17（3）：387-389.

Effects of GSPE and UVA on the Proliferation of HaCaT Cells

Shi Xianhua1，Zhang Junling2，Kang Yuan3
1.Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，China；2.Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital 300120，China；3.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

ObjectiveIn order to observe the effects of GSPE and UVA on the proliferation of HaCaT cells，and to investigate the light protection of GSPE.MethodsThe cells proliferation were detected by MTT method.ResultsThe impact on HaCaT cells proliferation was not obvious when the concentration of GSPE was lower than 200 μg/mL.But when the concentration of GSPE was more than 500 μg/mL could significantly inhibit the growth of the cells.It could inhibit the growth of HaCaT cells when the dose of UVA was more than 10 J/cm2.And the 25 J/cm2dose of UVA could inhibit the proliferation of HaCaT cells to 37.65%.The concentration of 50 μg/mL and 100 μg/mL of GSPE could promote the proliferation of HaCaT cells which were irradiated by 25 J/cm2dose of UVA.ConclusionThe 25 J/cm2dose of UVA could inhibit the proliferation of HaCaT cells significantly.And appropriate concentration of GSPE can play a role in light protection.

Grape seed proanthocyanidin extract；Ultraviolet A；HaCaT cells长波紫外线（UVA）是皮肤老化的重要因素，为进行皮肤光老化的相关研究，需选取合适的光照剂量，并选取安全范围大的药物及合适的浓度进行光保护的研究。葡萄籽提取物原花青素（Grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）具有极强的抗氧化及清除自由基活性，其是否能通过影响细胞增殖起到光保护作用，暂未见报道，基于此进行如下研究，为探讨其延缓光老化等相关作用提供理论依据。

R758.7

A

1672-0709（2016）03-0136-03

中华医学会皮肤性病学分会-微诺娜皮肤病学研究基金

张峻岭，E-mail:zhangjunlingtj@126.com

2015-10-15）