组胺H4受体在过敏性紫癜患者外周血及肾脏组织中的表达

雷蕾，蒋瑾瑾，周霖，顾军（第二军医大学附属长海医院，上海 200433）

论著

组胺H4受体在过敏性紫癜患者外周血及肾脏组织中的表达

雷蕾，蒋瑾瑾，周霖，顾军
（第二军医大学附属长海医院，上海 200433）

目的比较过敏性紫瘢（HSP）患者外周血及肾脏组织H4R的表达情况，初步探讨H4R在HSP中作用。方法收集126名初次发病HSP患者及94名健康体检者外周血标本，利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，分别比较HSP急性期组与健康对照组之间、HSP急性期不同临床表型之间H4RmRNA的表达情况。收集HSP肾脏损害患者肾活检标本及健康肾组织标本，利用免疫组化比较H4R的表达情况。结果HSP急性期患者外周血单个核细胞表面H4R mRNA表达水高于健康对照组（P＜0.01）。肾脏受累组外周血单个核细胞表面H4R的表达明显高于单纯皮肤组、非肾病混合组（P＜0.01）。肾脏受累组肾脏组织中H4R表达呈阳性，以肾小管为主，阳性率明显高于健康对照组（P＜0.01）。结论H4R可能参与了HSP的急性期发病，且与HSP患者的肾脏受损有关。肾脏H4R的高表达可能影响HSP的病程及预后。

组胺H4受体，过敏性紫癜，肾脏损害

组胺H4受体是组胺受体家族中最新的成员［1］，主要分布于人体免疫系统的各类细胞（嗜酸性粒细胞，树突状细胞，T淋巴细胞等），在人体的多种自身免疫性疾病、变态反应性疾病及各类炎症反应中发挥作用［2-3］。有研究发现，组胺H4受体在肾脏的髓襻部有表达，并参与了糖尿病肾病的发病［4］。过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura，HSP）作为儿童及青少年中最为常见的系统性血管炎性病变之一，合并的肾脏损害是影响该病预后的重要因素。笔者在前期的研究中发现：组胺H4受体参与了HSP的急性发病过程。本文通过比较HSP患者外周血及肾脏组织H4R的表达情况，初步探讨H4R在HSP中作用。

1　对象与方法

1.1研究对象126例HSP患者来自2012年6月—2014年7月在上海长海医院就诊的患者，其中男60例，女66例，均为病程在1周内的首次发病，年龄为2.5～15岁，平均（9.85±4.73）岁。所有患者在入院前4周内均未使用任何抗过敏药物、糖皮质激素或细胞毒性药物；受试对象采血前24 h未使用任何药物；病程中出现肾损害者共42例，其中接受肾脏活检13例。健康对照组：94例，外周血来自我院体检者。男52例，女42例；5例对照肾组织标本取自手术切除的正常肾组织，并经病理证实肾脏形态正常。HSP的诊断符合1990年美国风湿病学会制定的诊断标准［5］。

1.2主要试剂PCR引物设计与合成（Invitrogen公司），兔抗人anti-H4R（Abcom公司），PV9000试剂盒，DAB显色试剂盒（上海生工生物工程有限公司），人淋巴细胞分离液（上海生工生物工程有限公司），RNA提取试剂（武汉博士德生物工程有限公司）、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂（Biotnt公司）

1.3研究方法

1.3.1外周血H2R及H4R mRNA的检测抽取患者治疗前外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，在2 h内用密度梯度离心法分离并提取外周血单个核细胞（PBMC），Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇法浓缩RNA，逆转录合成cDNA，并以cDNA为模板进行Real-timePCR合成，用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA后，再用定量PCR仪进行定量PCR检测。见表1。

表1　目标基因及内参基因的引物序列

1.3.2免疫组织化学染色检测H4R在肾脏组织中的分布在B超引导下细针穿刺获得病理组织，经常规石蜡包埋切片，制成HE片，并标记兔抗人H4R多克隆抗体，经DAB显色后阅片。评价方法：选5个高倍镜（×400）视野，分别计数100个细胞。阳性细胞数所占百分比：0为阴性，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐色为3分。以上两者乘积＞3分为阳性［6］。

1.4统计学方法所有数据均采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验；计量资料用均数±标准差（±s）表示，2组间均数的比较采用t检验，F检验验证方差齐性，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1HSP患者外周血中H4R mRNA的表达根据不同临床表现，将急性期HSP患儿分为单纯皮肤组、非肾病混合组以及肾脏受累组。结果显示：各型HSP患儿外周血单个核细胞H4R mRNA表达水平均高于健康对照组（P＜0.01）；肾脏受累组H4R mRNA表达水平高于单纯皮肤组以及非肾病混合组（t=5.151，2.822；P=0.000 2，0.009），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2HSP急性期患儿外周血单个核细胞H4R mRNA水平

2.2HSP患者肾脏组织中H4R的表达在肾脏病理组织中发现，肾脏受累组中肾小管上皮细胞胞浆可见弥漫性细颗粒状棕黄色着色，弥漫，及少许肾小球系膜细胞胞浆可见明显着色，阳性表达率为84.6%，而健康对照组中仅少许肾小管上皮细胞胞浆淡染，阳性率为0%，两者差异有统计学意义（χ2= 10.879，P=0.001），见图1。

图1HSP患儿肾脏组织中H4R的表达（免疫组化染色×400）

3　讨论

H4R作为新发现的一类组胺受体，其生物学功能与之前发现的组胺受体有明显的不同。其主要广泛表达于各种免疫细胞，并对多种细胞起到趋化调节作用。有研究发现DC细胞膜上的H4R活化步骤是调节Th极化的关键，H4R可以通过抑制DC产生IL-12p70［7］，上调IL-10、IL-16、IL-6、ICAM-1等多种炎症因子及趋化因子［8］，从而促进Th细胞向Th2型漂移［9］。在H4R介导下，可以通过作用于DC促进人和小鼠Th2细胞极化，从而引起嗜酸性粒细胞肌动蛋白的聚合，并促使其迁移［10］。在哮喘小鼠体内，通过特异性抗体JNJ7777120阻断DC表面的H4R，或者敲除H4R基因，可以明显地减少嗜酸性粒细胞数量及IgE水平［11］。另有研究发现，通过阻断过敏患者体内DC表面的H4R，可以明显地抑制抗原特异性T细胞的免疫应答［12］。说明H4R在多种炎症反应中起到免疫调控作用。

在对HSP患者外周血中H4R的表达进行对比后，笔者发现急性期HSP中H4R mRNA的表达较健康对照组明显升高。我们推测当H4R活化，通过作用于DC，引起多种细胞因子及趋化因子水平的改变，并进一步影响T细胞的分化，导致TH1下调，TH2优势活化，从而参与了HSP急性期的发病。通过对不同临床表型的HSP进行比较，发现肾脏受累的HSP患儿外周血H4R的表达要高于单纯皮肤组及无肾脏受累的混合组。由于肾脏改变是影响HSP病程及预后的关键，而H4R可作用于免疫细胞表达多种趋化因子及黏附分子［8］，并使其从血液迁移至炎症局部［13］。因此我们进一步观察了肾脏组织中的H4R的表达情况。发现急性期HSP患儿肾脏组织中H4R呈明显的高表达，并且主要表达于肾小管细胞，而在对照组中，仅有少量肾小管细胞淡染。提示H4R与HSP患者的肾脏受损有关。

目前常规的肾脏病理分级标准中多以有无细胞增殖、新月体，以及新月体的百分比为标准。近年来的研究表明肾小管及肾间质的损伤是影响紫癜性肾炎患者预后的重要因素之一。有文献报道，髓袢坏死、内皮细胞增生及间质区炎症细胞浸润等肾小管间质改变多与肾小球新月体形成，肾小球系膜增生，肾小球硬化等密切相关［14］，且肾小管-间质损害与否可影响与肾脏病理分级有相关性［15］。本研究发现，HSP肾脏损害组外周血H4R的表达高于其他临床表型，而肾活检亦发现肾脏损害患儿H4R表达呈阳性，且主要表达于肾小管。提示H4R在肾脏的高表达可能与HSP的病程及预后有关。

综上所述，笔者分析外周血单个核细胞上的H4R可能通过作用于DC、嗜酸性粒细胞、T细胞等多种免疫细胞，引起多种细胞因子及趋化因子水平的改变，参与急性期HSP免疫功能紊乱发生发展。而表达于肾脏局部的H4R被活化后，表达上调，激活肾脏固有细胞，产生细胞因子，参与组织损伤；促进炎症细胞浸润及趋化。但H4R在HSP中具体的调节通路，在不同肾脏病理类型中的表达情况仍有待进一步研究。

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Expression of Histamine H4 Receptor in Peripheral Blood Mononuclear Cells and Kidney of HSP Patient

Lei Lei，Jiang Jinjin，Zhou Lin，Gu Jun
Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China

ObjectiveIn order to detect the expression of histamine H4 receptor（H4R）in peripheral blood mononuclear cells and kidney of HSP Patients and to explore its role in the pathogenesis of HSP.MethodsRT-PCR was employed to detect the expression of H4R mRNA in peripheral blood mononuclear cells from 126 patients with HSP and 96 healthy controls. Immunohistochemical staining was employed to detect the expression of H4R renal tissue in 15 HSP patients and 6 healthy controls.ResultsThe level of H4R mRNA from peripheral blood mononuclear cells in HSP patients was significantly higher than that in controls（P＜0.01）.The level of H4R mRNA from PBMC in the level of H4R mRNA from peripheral blood mononuclear cells in HSP patients was significantly higher than skin group and non-renal involved group（P＜0.01）.H4R mainly expressed in the human renal tubules of renal involved group，and the positive rate was 86%.While the positive rate of controls were 0.00%（P＜0.01）.ConclusionH4R may be involved in the acute phase of HSP and associated with the renal injury.The H4R high expression of renal may affect the prognosis of HSP.

Histamine 4 receptor；Henoch-Schönlein purpura；Renal involvement

R729

A

1672-0709（2016）03-0133-03

上海市卫计委青年基金项目。编号：20134y194

顾军，E-mail：gujun79@163.com

2015-12-20）