CD4+CD25+调节性T细胞及其细胞因子在寻常型银屑病患者的改变

赵宏丽，郭永铁（天津市中医药大学第一附属医院，天津 300073）

CD4+CD25+调节性T细胞及其细胞因子在寻常型银屑病患者的改变

赵宏丽，郭永铁
（天津市中医药大学第一附属医院，天津 300073）

目的探讨寻常型银屑病患者CD4+CD25+调节性T细胞及其细胞因子的改变。方法用流氏细胞仪直接免疫荧光法检测寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+T细胞的百分率、FoxP3+分子表达、细胞因子白细胞介素（IL）-10、转化生长因子（TGF）-β的表达。结果 寻常型银屑病患者CD4+CD25+T细胞在进行期组、静止期组、健康对照组结果分别是4.55±1.11、5.26±1.38、6.03±1.96，CD4+CD25+FoxP3+T细胞在进行期组、静止期组、健康对照组结果分别是3.85±0.89、4.31±1.26、4.95±1.37。进行期患者明显低于静止期患者和健康对照组（P＜0.05）；而静止期患者与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CD4+CD25+IL-10+细胞、CD4+CD25+TGF-β+T细胞在进行期组、静止期组、健康对照组结果分别是11.57±5.64、14.49±8.26、16.35±9.98；2.65±0.97、4.23±1.55、4.83±1.84；进行期患者明显低于静止期患者和健康对照组（P＜0.05）；而静止期患者与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CD4+CD25+FoxP3+T细胞与PASI呈负相关（r=-0.659，P＜0.05）；CD4+CD25+IL-10+T与PASI呈负相关（r=-0.537，P＜0.05）；而CD4+CD25+TGF-β+T细胞与PASI直线相关（r=-0.184，P＞0.05）。结论CD4+CD25+调节性T细胞的比例以及Foxp3的表达、IL-10、TGF-β的表达明显下降，导致调节性T细胞的抑制功能缺陷，进而影响银屑病病情的发展。可以推测，调节性T细胞的数量或功能异常，均将影响银屑病的发病。

寻常型银屑病；CD4+CD25+调节性T细胞；FoxP3；白细胞介素-10；转化生长因子-β

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，主要表现为表皮角质细胞过度增生和炎症细胞浸润，其发病机制尚不明确，现常用外用药物或光线疗法控制其病情的发展，但不能根治且易复发。机体内许多免疫细胞均参与其发病过程，如树突细胞、角质形成细胞、T淋巴细胞，是一种免疫调节功能失衡相关的疾病。调节性T细胞是一群独特的免疫调节细胞，具有免疫抑制作用，日渐受到关注，尤其是CD4+调节性T细胞［1］。它们在正常人体稳态的维持，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及病毒感染等病理状态下都起着重要作用，与寻常型银屑病的免疫病理过程和病情密切相关［2］。

1　对象与方法

1.1对象寻常型银屑病患者65例，其中男36例，女29例，年龄13～68岁，平均（35.9±15.3）岁，来自我院2015年3月—2015年11月门诊及住院患者，均符合寻常型银屑病的诊断标准：具有典型的红斑、银白色鳞屑等皮疹，均经临床与组织病理检查确诊。其中寻常型银屑病患者轻度28例［1＜寻常型银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）≤25］，重度37例（PASI＞25）［3］。所有患者1个月内未使用皮质类固醇激素和免疫抑制剂。对照组58例天津地区健康献血员，男27例，女31例，年龄21～41岁，平均（35.3±4.3）岁。

1.2仪器和试剂主要仪器：流式细胞仪（美国BD公司，FACS calibuy）。主要试剂：CD4-FITC，CD25-APC，FoxP3-PE，mouse γ1 APC，mouse γ 1 FITC，rat IgG2a PE，抗IL-10-FITC、生物素化抗TGF-β1抗体、亲和素-FITC，溶血素，破膜剂，PHA均购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1CD4+CD25+T细胞检测取静脉血2 mL肝素抗凝，取2支试管，一支试管加100μL全血，20μL 抗CD4-FITC，20 μL抗CD25-APC标记抗体；另一只试管加100 μL全血，20 μL mouse γ1 APC，20 μL mouseγ1FITC。室温避光20min；加溶血素2mL，室温避光10 min；1 000 r/min，离心10 min；弃上清，加磷酸盐缓冲液（PBS）2 mL，1 000 r/min，离心10 min；弃上清，加PBS 2 mL，1 000 r/min，离心10 min；弃上清，加500 μL 1%多聚甲醛固定，24 h内上机分析。

1.3.2FoxP3+T细胞检测取静脉血3 mL肝素抗凝，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），1×106个细胞中加入抗CD4-FITC，抗CD25-APC，mouse γ1 APC，mouse γ 1 FITC，各20 μL，混匀，4℃避光孵育30 min；加入1 mL破膜剂，避光孵育45 min；加入20 μL抗FoxP3-PE，rat IgG2a PE，避光孵育30min，洗涤2次后，上流式细胞仪（FCM）检测。

1.3.3细胞因子IL-10、TGF-β1的检测无菌采集外周静脉血10mL，肝素钠抗凝，Ficoll淋巴细胞分层液的密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，移入RPMI 1640（含10%胎牛血清）培养基中，加20 ng/mL植物血凝素A（PHA）刺激，37℃、5%CO2培养24 h。收集培养液中细胞于流式反应管中，加入抗CD4-PE，抗CD25-APC，mouseγ1APC，mouseγ1FITC，各20 μL，混匀，4℃避光孵育30 min；加入1 mL破膜剂，避光孵育45 min；分别加入抗IL-10-FITC、生物素化抗TGF-β1抗体、亲和素-FITC，室温避光20 min，PBS洗涤重悬后即采用FCM进行检测。

1.3.4数据分析FCM各项数据采用CellQuest软件进行分析，根据前向散射光和侧向散射光调节PMT1和PMT2，以相应同型染色细胞作为阴性对照调节FL1和FL2。

1.4统计学处理用SPSS13.0软件，采用单因素方差分析以及Pearson相关分析。

2　结果

2.1CD4+CD25+T细胞结果分析寻常型银屑病患者进行期组、静止期组、对照组CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25+FoxP3+T细胞结果见表1。进行期患者明显低于静止期患者和对照组（P＜0.05）；而静止期患者与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　寻常型银屑病患者CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25+FoxP3+T细胞结果　（%）

2.2CD4+CD25+T细胞IL-10、TGF-β的表达情况以CD4+T细胞设门，计算CD25+IL-10+T细胞和CD25+TGF-β+T细胞的百分率，结果见表2。进行期患者CD4+CD25+IL-10+细胞、CD25+TGF-β+T细胞明显低于静止期患者和对照组（P＜0.05）；而静止期患者与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2CD4+CD25+T细胞IL-10、TGF-β的表达情况（%）

2.3与疾病严重程度PASI积分的相关性分析CD4+CD25+FoxP3+T细胞与PASI呈负相关（r=-0.659，P＜0.05）；CD25+IL-10+T与PASI呈负相关（r=-0.537，P＜0.05）；而CD25+TGF-β+T细胞与PASI无直线相关性（r=-0.184，P＞0.05）。

3　讨论

T淋巴细胞浸润是银屑病的重要病理特征之一［4］。目前大量研究证实银屑病患者外周血和皮损中CD4+CD25+调节性T细胞的数目和功能明显低于正常人，患者体内存在对效应性T细胞的调节功能缺陷［5］。FoxP3是转录因子叉头家族的新成员。FoxP3基因特征性表达于胸腺及外周血的CD4+CD25+T细胞的细胞核，在CD4+CD25-T细胞、CD8+T细胞、B细胞等均无明显表达，可作为调节性T细胞的一个特异性标记［6］，在调节性T细胞分化、发育和功能发挥方面起着至关重要的作用［7］。人体内FoxP3基因的突变可能会导致自身免疫疾病的发生。FoxP3调控调节性T细胞功能主要通过3种途径：①与其他转录因子相互作用，形成蛋白复合体，动态调控Treg的功能；②通过特异性调控FoxP3的转录水平，影响Treg的免疫作用［8］；③对FoxP3蛋白进行翻译后修饰调控间接影响Treg的功能。

Tr细胞分泌的两个重要的细胞因子为IL-10和TGF-β［9］。IL-10是CTL分化因子及B细胞活化因子，在天然免疫过程中是重要的负调节因子。IL-10可直接抑制IL-2的产生。CD25分子即为IL-2Rα链，CD25+T细胞介导抑制作用的机制之一就是被动地吸收由效应细胞产生的IL-2。IL-10还具有抑制前炎症细胞因子的产生，抑制抗原特异性T细胞的激活，抑制Th17细胞的增殖［10］，抑制单核细胞表达MHC-1Ⅰ类抗原和辅助刺激分子，抑制单核细胞和巨噬细胞产生NO［11］等功能。TGF-β参与诱导CD4+T细胞向CD4+CD25+FoxP3+T细胞的分化［12］。TGF-β和IL-6共同作用可促使初始T细胞分化为Th17细胞，Th17细胞通过产生一系列促炎因子，加重银屑病皮损处的炎症反应。此外，TGF-β是一个多效性细胞因子，在骨的形成中发挥着重要作用，可抑制骨吸收，促进成骨细胞的合成、分泌、增殖和分化，增加骨的钙化。近来的研究表明TGF-β的异常改变参与银屑病的发生发展［13］。

本研究结果显示寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例低于健康对照组，而且进行期患者明显低于静止期患者和健康对照组；而静止期患者与健康对照组相似。进行期患者CD4+CD25+FoxP3+T占CD4+T细胞的比例明显低于静止期患者和健康对照组；而静止期患者与健康对照组相似。进行期患者Tr分泌的IL-10、TGF-β均低于静止期患者和健康对照组（P＜0.05），而静止期患者与健康对照组相似。进而与疾病严重程度PASI积分比较，发现CD4+CD25+FoxP3+T细胞、IL-10均与疾病严重程度PASI积分呈负相关；而TGF-β与疾病严重程度PASI积分无直线相关性。

综上所述，银屑病患者体内可能存在调节性T细胞数量的减少以及免疫调节功能的缺失，进而影响银屑病病情的发展。对银屑病患者体内调节性T细胞的深入研究，可能会进一步揭示其发病机制，为临床诊断、治疗与预防提供重要的理论依据。

［1］Lehtimäki S，Lahesmaa R.Regulatory T cells control immune responses through their non-redundant tissue specific features［J］. Front Immunol，2013，4：294.

［2］Salvi M，D'EPiro S，Mattozzi C，et al.Importance of regulatory T cells in the pathogenesis of psoriasis：review of the literature［J］. Dermatology，2013，227：134-145.

［3］张长宋，赵天恩，陈树民.银屑病病情严重程度评判指标的研究现状［J］.国外医学·皮肤性病学分册，2002，28（2）：82-84.

［4］Gulletta E，Bottoni U，Foti DP.Psoriasis，a new challenge for laboratory medicine［J］.Clin Chem Lab Med，2013，51：1363-1368.

［5］Cai Y，Fleming C，Yan J.New insights of T cells in the pathogenesis of Psoriasis［J］.Cell Mol Immunol，2012，9：302-309.

［6］Hoffmann P，Boeld TJ，Eder R，et al.Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation［J］.Eur J Immunol，2009，39：1088-1097.

［7］Bonelli M，Dalwigk K，Savitskaya A.Foxp3 expression in CD4+T cells of patients with systemic lupus erythematosus：a comparative phenotypic analysis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67：664-671.

［8］Haiqi H，Yong Z，Yi L.Transcriptional regulation of Foxp3 inregulatory T cells［J］.Immunobiology，2011，216：678-685.

［9］Cho MK，Park MK，Kang SA，et al.Trichinella spiralis infection suppressed gut inflammation with CD4+CD25+Foxp3+T cell recruitment［J］.Korean J Parasitol，2012，50：385-390.

［10］Rudensky AY，Roncarolo MG，Battaglia M，et al.Th17 cells express interleukin-10 receptor and are controlled by FoxP3（-）and FoxP3（+）regulatory CD4（+）T cells in an interleukin-10-dependent manner ［J］.Immunity，2011，34：554-565.

［11］Gregori S，Tomasoni D，Pacciani V，et al.Differentiation of type 1 T regulatory cells（Tr1）by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway［J］.Blood，2010，116：935-944.

［12］Zhang W，Wu K，He W，et al.Transforming growth factor beta 1 plays an important role in inducing CD4+CD25+forhead box p3（+）regulatory T cells by mast cells［J］.Clin Exp Immunol，2010，161：490-496.

［13］Chen Y，Dawes PT，Packham JC，et al.Interaction between smoking and functional polymorphism in the TGF-β1 gene is associated with ischaemic heart disease and myocardial infarction in patients with rheumatoid arthritis：a cross-sectional study［J］.Arthritis Res Ther，2012，14：R81.

Changes of CD4+CD25+Regulatory T cells and Cytokines in Psoriasis Vulgaris Patients

Zhao Hongli，Guo Yongtie
First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300073，China

ObjectiveIn order to investigate the change of CD4+CD25+regulatory T cells and cytokines in psoriasis vulgaris. Methods The direct immunofluorescence assay was used to detect CD4+CD25+T cell，FoxP3+，IL-10 and TGF-β by flow cytometry.ResultsThe percentage of CD4+CD25+T cell in active stage（4.55±1.11）%was lower than that in stationary stage［（5.26±1.38）%］and the control group［（6.03±1.96）%，P＜0.05］.The percentage of CD4+CD25+FoxP3+Tcell in active stage were lower than that in stationary stage and control group（P＜0.05）.However，there was no statistical significant difference in stationary stage and control group（P＞0.05）.CD4+CD25+IL-10+Tcell and CD4+CD25+TGF-β+Tcell decreased in active stage（P＜0.05），but there was no statistical significance in stationary stage and the control group（P＞0.05）.There was positive relationship between CD4+CD25+FoxP3+Tcell and PSAI（r=-0.659，P＜0.05）.And there was positive relationship between CD25+IL-10+Tcell and PSAI （r=-0.537，P＜0.05）.However，no correlation was found between CD25+TGF-β+T cell and PASI（r=-0.184，P＞0.05）.Conclusion The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells and the expression of Foxp3，IL-10 and TGF-β are significantly decreased.It results in the defect of inhibition function，and then influenced the development of psoriasis disease.It suggests that the abnormal of regulatory Tcells'number and function can influence of psoriasis pathogenesis.

Psoriasis vulgaris；CD4+CD25+regulatory Tcell；FoxP3；Interleukin-10；Transforming growth factor-β

R758.63

A

1672－0709（2016）03-0139－03

2016-01-06）