基于连作障碍条件下穿山龙皂苷类活性成分的含量变化

孙　鹏，尹海波，姚　佳



基于连作障碍条件下穿山龙皂苷类活性成分的含量变化

孙鹏1，尹海波2*，姚佳2

1.沈阳市第七人民医院，沈阳 110003;2.辽宁中医药大学药学院，大连 116600

[摘要]目的采用高效液相色谱法对不同连作条件下穿山龙中的皂苷类活性成分进行含量测定，探讨不同连作条件对于穿山龙皂苷类活性成分含量的影响。方法采用RP-HPLC，色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-水(B) 为流动相梯度洗脱；流速1.0 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长：203 nm，计算皂苷类成分含量，并采用SPSS等软件对所得结果进行分析。结果吉林通化种植基地的穿山龙中，除了甲基原薯蓣皂苷为连作一茬3年时含量最高，其他三种皂苷类成分原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷均为正茬4年时最高，而后随着连作年限的增加，含量逐渐减少，并且原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷含量呈正相关。结论穿山龙随着连作年限的增加，其皂苷类活性成分的含量也随之下降，说明连作障碍对其皂苷类活性成分的含量积累造成了影响，但正茬4年时其皂苷类成分总含量最高，提示正茬4年为采收最佳时间，这为该药材的质量控制及GAP规范种植提供了依据和示范。

[关键词]穿山龙；高效液相色谱；连作障碍

0　引言

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣DioscoreanipponicaMakino的地下干燥根茎[1]，于2015年版《中国药典》一部中收载[2]，其有效成分为甾体皂苷类。其皂苷和皂苷元有抗肿瘤作用[3-4]，具有很好的药用价值，现代已作为甾体激素药物和抗冠心病皂苷类药物的重要工业原料[5]。经考察该药材目前存在野生资源严重匮乏的现状，巨大的市场需求迫切需要大量种植穿山龙，而种植实践中因其连作障碍问题突出，表现为地上叶片生长较弱、植株生长不良、病害严重、不能正常形成具有药用和商品价值的根茎，造成产量和品质明显下降。

目前,该药材多用薯蓣皂苷作为药材质量控制指标[6-7]，原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的同时测定也有报道[8]。本实验通过对不同连作条件下穿山龙中的皂苷类活性成分进行含量测定，探讨连作障碍对于穿山龙皂苷类活性成分含量的影响，为指导该药材GAP规范种植提供依据。

1　材料

1.1仪器与试剂Aglient 1100高效液相色谱仪，KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，CP225D电子天平(德国Sartorius公司)，100G药材粉碎机(浙江武义屹立工具有限公司)。乙腈为色谱纯，乙醇(95%)为分析纯，水为重蒸水。薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及纤细薯蓣皂苷(上海源叶生物工程有限公司，纯度≥98%)。

1.2药材所用穿山龙药材2013年5月收集于吉林省通化市头道镇，具体见表1，经本院尹海波教授鉴定为穿龙薯蓣DioscoreanipponicaMakino，凭证标本保存于本院药用植物教研室。

表1　药材采集信息

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；体积流量：1.0 mL/min，流动相：A-乙腈，B-水，梯度洗脱：0～10 min，25%～27%A；10～16 min，27%～35%A；16～20 min，35%～44%A；20～35 min，44%～54%A；35～40 min，54%～56%A；进样量：10 μL。

2.2对照品溶液的制备分别精密称取原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷对照品2.63、2.02、5.09、2.53 mg，置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀备用。

2.3供试品溶液的制备精密称定穿山龙药材粉末0.5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，超声提取2次，每次加入30倍量75%乙醇15 mL，每次30 min，合并2次滤液，浓缩定容于25 mL容量瓶中，摇匀，0.45 μL微孔滤膜滤过，取续滤液备用。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察精密量取4种对照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL注入高效液相色谱仪中，以对照品进样量质量为横坐标，峰面积为纵坐标，得原薯蓣皂苷回归方程为Y=93.864 X+9.369 2，r=0.999 6，线性范围为0.21～1.05 μg；得纤细薯蓣皂苷回归方程为Y=91.922 X+31.07，r=0.999 5，线性范围为0.01～4.04 μg；得甲基原薯蓣皂苷回归方程为Y=75.376 X+117.35，r=0.999 5，线性范围为2.036～20.36 μg；得薯蓣皂苷回归方程为Y=170 X+47.811，r=0.999 6，线性范围为1.01～10.1 μg。结果表明线性关系良好。

2.4.2精密度试验精密吸取同一供试品试液10 μL，重复进样6次，按照“2.1”项下色谱条件测定峰面积，原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷的峰面积RSD分别为0.7%、0.9%、0.6%和0.8%(n=6)。结果表明，本实验精密度符合规定。

2.4.3重复性试验精密称取混合均匀的药材粉末6份，按“2.3”项下制备供试品溶液，分别进样10 μL，按照“2.1”项下色谱条件测定峰面积并计算原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷的含量，RSD分别为1.9%、2.3%、1.7%和1.8%(n=6)。结果表明，待测组分重复性良好。

2.4.4稳定性试验精密吸取同一供试品试液，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10 h测定原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷的峰面积，RSD分别为1.6%、1.2%、1.1%和2.0%。结果表明，供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.4.5加样回收率试验取已知质量分数的药材粉末6份，精密称定，每份0.25 g，每组按低、中、高浓度分别加入相当于药材含量80%、100%、120%的各对照品溶液(n=2)，按照“2.1”项下色谱条件检测，计算得原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷的平均回收率分别为99.9%、99.8%、100.1%和98.6%，RSD分别为0.7%、0.8%、1.1%和1.5%，说明该方法准确率较高。结果见表2。

2.5样品测定分别取供试品溶液和对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，以外标法计算各样品中原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、甲基原薯蓣皂苷及薯蓣皂苷的含量，色谱图见图1，结果见表3。

2.6相关分析利用SPSS 17.0统计软件对4种皂苷类活性成分进行相关性分析，计算得原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的Pearson简单相关系数r=0.973，双侧检验P=0.001，在0.01水平上，两指标呈显著相关，具有统计学意义。

表2　加样回收率试验

图1　混合对照品HPLC色谱图(上)及样品HPLC色谱图 (下)

生长年限 正茬2年正茬3年正茬4年连作一茬1年连作一茬3年连作二茬4年原薯蓣皂苷04.0024.7532.1541.9091.562纤细薯蓣皂苷00.0564.631000甲基原薯蓣皂苷8.14344.04993.74738.464116.48630.225薯蓣皂苷4.80924.84433.80921.18516.99113.982皂苷类成分总含量12.95172.951136.93961.802135.38645.77

3　讨论

3.1本实验采用高效液相色谱法测定了穿山龙中皂苷类活性成分的含量，其方法简单、快速、准确度高，重现性好，可用于该药材的质量控制。

3.2通过对皂苷类成分的相关性分析可知，吉林通化种植基地的穿山龙药材中，原薯蓣皂苷与薯蓣皂苷的含量呈正相关。

3.3由表3可以看出，吉林通化种植基地的穿山龙中，三种皂苷类成分原薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷均为正茬4年时最高，甲基原薯蓣皂苷为连作一茬3年时含量最高，但正茬4年的甲基原薯蓣皂苷含量仅次于连作一茬3年的，且正茬4年的皂苷类成分总含量为最高，提示正茬4年为采收最佳时间，这为穿山龙的合理种植及品质评价提供了参考和依据。

3.4从表3还可看出，随着连作年限的增加，穿山龙皂苷类成分总含量也随之下降，说明连作障碍对其皂苷类活性成分的含量积累造成了影响，从而证明连作不利于穿山龙的种植栽培，这与实践种植生产的情况亦相符。由以上分析可知，种植栽培穿山龙忌连作，应在正茬4年即对穿山龙进行采收以保证其皂苷类含量最高，从而获得高质量的穿山龙药材，这为探讨该药材连作障碍的机理，指导该药材GAP规范的种植提供了依据。

参考文献：

[1]肖培根.新编中药志.第1卷[M].北京:化学工业出版社,2002:745.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2015:250.

[3]陈信义,高志捷,王玉芝,等.薯蓣皂苷抗移植性小鼠乳腺癌作用的研究[J].中国中医药信息杂志，2005,12(5)：23.

[4]王丽娟,王岩,陈声武,等.薯蓣皂苷元体内、外的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志,2002,27(10):777.

[5]中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京:科学出版社,1994:1414.

[6]李克明，董莹，张永文，等.RP-HPLC法测定穿山龙中薯蓣皂苷的含量[J].药物分析杂志，2004，24(6)：640-641.

[7]祁伟，何键，及元乔，等.HPLC-ELSD法测定两种薯蓣属植物中薯蓣皂苷的含量[J].天然产物研究与开发，2007，19：84-86.

[8]刘中博，王铁杰，卢忠强，等.HPLC法同时测定穿龙薯蓣中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷[J].中草药，2008，39(5)：774-776.

收稿日期：2015-12-01

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603021

Change of the content of active ingredient saponins inDioscoreaenipponicaeRhizoma under conditions of continuous cropping obstacle

SUN Peng1，YIN Hai-bo2*，YAO Jia2

(1.Shenyang No.7 People′s Hospital,Shenyang 110003,China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

【Abstract】ObjectiveHPLC method is used to determine the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma under different conditions of continuous cropping obstacle and to study the effect of continuous cropping obstacle on the content of active ingredient saponins.MethodsSamples were achieved and separated by Agilent TC-C18column( 250 mm×4.6 mm，5 μm)with acetonitrile-water as mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 35 ℃,the UV detector was set at 203 nm,ingredients saponins content was calculated,and SPSS software was used to analyze the results.ResultsIn the Dioscoreae nipponicae Rhizoma,in the plantation base in Tonghua of Jilin province,except Methyl protodioscin which had the highest content at 3 years,the other three saponins,including protodioscin,diosgenin slim and dioscin had the highest content at four years,and then with the increase of years,the content gradually decreased,and the content of protodioscin and diosgenin was positively correlated.ConclusionWith the increase of continuous cropping,the content of active ingredient saponins in Dioscoreae nipponicae Rhizoma decreases,which indicates that continuous cropping obstacle affects the content accumulation of active ingredient saponins.Due to the fact that the content is the highest at four years,4 years is the best time to harvest, which provide the basis and model for the quality control of the medicine and for GAP standerdized planting.

Key words：Dioscoreae nipponicae Rhizoma；HPLC；Continuous cropping obstacle