红净胶囊质量标准研究

康玉霞，雷　丸，王　莹，郭飞燕，王晓娟*



·药学研究·

红净胶囊质量标准研究

康玉霞1,2，雷丸2，王莹2，郭飞燕2，王晓娟2*

1.陕西中医学院药学院，咸阳 712046；2.军事口腔医学国家重点实验室，第四军医大学口腔医院药剂科，西安 710032

[摘要]目的建立红净胶囊的质量标准。方法采用显微鉴别法鉴别本制剂中的冰片和三七；采用薄层色谱法(TLC)鉴别丹参、冰片和三七；采用高效液相色谱法(HPLC)测定沙利度胺的含量，色谱柱为Inertsustain C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85，v/v)；检测波长为237 nm。结果在选定的薄层色谱条件下，斑点显色清晰，分离效果良好。沙利度胺浓度在40.32～141.12 μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)；平均回收率为98.27%，RSD为1.44%(n=9)。结论该方法简便可行，专属性强，重现性好，可用于红净胶囊的质量控制。

[关键词]红净胶囊；薄层色谱法；高效液相色谱法；沙利度胺

0　引言

红斑是真皮乳头层毛细血管网局限性或全身性扩张而产生局部或全身性的红色斑疹，又称红斑狼疮(Lupus erythematosus，LE)。LE是一种环境、基因和免疫等多种因素作用下的自身免疫疾病[1-2]，临床上表现为多系统损害，有较高的发病率和死亡率，发病机制较为复杂[3-4]。由第四军医大学口腔医院研制的复方制剂红净胶囊具有活血化瘀、清心除烦之功效。本制剂由沙利度胺、丹参、冰片、三七等组成，沙利度胺为本制剂的主要药效成分，具有治疗多发性红斑、红斑狼疮、结节性红斑等功效。为控制药品质量，保证药品疗效，笔者对红净胶囊的质量标准进行研究，采用显微鉴别法、薄层色谱法对冰片、三七和丹参进行鉴别，采用高效液相色谱法对沙利度胺进行含量测定，建立可控制该制剂质量的标准。

1　仪器与试药

数码显微镜(DMBH200，目镜×20倍、物镜×10倍，系统自带成像系统，宁波舜宇仪器有限公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ5200E型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；十万分之一电子天平(BT125D，德国赛多利斯公司)；丹参酮ⅡA对照品(批号：110766-200417，纯度：100%)、冰片化学对照品(批号：110743-200905，纯度：100%)、人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-201424，纯度：93.7%)、人参皂苷Rg1对照品(批号：110703-201128，纯度：93.4%)、三七皂苷R1对照品(批号：110745-200617，纯度：100%)、沙利度胺对照品(批号：130504-200501，纯度：100%)，均由中国食品药品检定研究院提供；红净胶囊(规格：220 mg/粒，12粒×2板/盒；批号：140915、141021、141211，第四军医大学口腔医院药剂科)；丹参阴性样品、冰片阴性样品、三七阴性样品、沙利度胺阴性样品，均为实验室自制；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为实验室自制纯化水。

2　方法与结果

2.1显微鉴别取冰片粉末适量置于载玻片上，滴加水合氯醛2～3滴，酒精灯加热至水合氯醛半干为止，加热时轻轻晃动载玻片，以免将水合氯醛蒸干。然后加稀甘油1滴，盖上盖玻片，赶走气泡，将制备好的冰片粉末切片置于显微镜下观察。可见淀粉粒多，呈单粒圆形、半圆形或圆多角形，直径4～30 μm，草酸钙簇晶稀少，树脂道破裂并含有黄色分泌物，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10余分粒组成。再取三七粉末适量，按照冰片的粉末制片方法制备三七粉末切片，置于显微镜下观察，可见棒状或多角形结晶，见图1。另取红净胶囊内容物适量，按照冰片的粉末制片方法制备供试品的粉末切片，置于显微镜下观察。可见：①淀粉粒多，呈单粒圆形、半圆形或圆多角形，直径4～30 μm，脐点点状或裂缝状，复粒由2～10余分粒组成；②棒状或多角形结晶。见图2。通过冰片、三七药材和供试品的显微结构对比，发现供试品的显微特征基本上与冰片和三七的显微特征相似，由此可判定供试品中含有冰片和三七。

2.2薄层色谱鉴别

2.2.1丹参、冰片的TLC鉴别取本品10粒，加乙醚15 mL，超声5 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2 mL复溶，作为供试品溶液。再取丹参酮ⅡA、冰片的对照品适量，分别加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。另取丹参阴性样品和冰片阴性样品按供试品的制备方法制备阴性对照溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液10 μL、对照品溶液5 μL，分别点在同一硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与丹参酮ⅡA对照品色谱相对应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图3；喷以1%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加热数分钟，在与冰片对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图4。

2.2.2三七的TLC鉴别取本内容物2 g，加水数滴润湿，再加水饱和的正丁醇15 mL，密塞，超声10 min，放置2 h，分取正丁醇层，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL,合并正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 mL复溶，作为供试品溶液。再取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品及三七皂苷R1对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。另取三七阴性样品按供试品的制备方法制备阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点在同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图5。

图1　冰片、三七显微鉴别

图2　红净胶囊显微鉴别

图3　丹参的TLC鉴别图谱

图4　冰片的TLC鉴别图谱

图5　三七的TLC鉴别图谱

2.3含量测定

2.3.1色谱条件[5]色谱柱：Inertsustain C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85，v/v)；检测波长为237 nm；流速：1.0 mL/min。

2.3.2溶液的制备对照品溶液的制备：精密称取沙利度胺对照品5.05 mg，置5 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，得1.01 mg/mL对照品储备溶液。精密吸取该对照品储备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.10 mg/mL的对照品溶液。供试品溶液的制备[6]：取红净胶囊10粒混合均匀，精密称取0.18 g，置25 mL量瓶中，加乙腈适量，超声处理30 min，取出，放冷，加乙腈定容至刻度。精密量取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀。阴性对照溶液的制备：取沙利度胺阴性样品适量，按上述方法制备阴性对照溶液。

2.3.3专属性试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按“2.3.1”项下的色谱条件进行测定。结果显示，供试品溶液与对照品溶液保留时间一致，阴性对照溶液在沙利度胺相应的保留时间未出现色谱峰，表明在该色谱条件下沙利度胺的吸收良好，红净胶囊中的其他成分对沙利度胺的测定无干扰。色谱图见图6。

图6　沙利度胺HPLC色谱图

2.3.4线性关系考察精密量取对照品储备溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为40.32、60.48、80.64、100.8、120.96、141.12 μg/mL的对照品系列溶液。精密吸取上述对照品系列溶液各10 μL，按照“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，以沙利度胺对照品的峰面积(Y)对沙利度胺的进样浓度(X)进行线性回归，得回归方程Y=23 388 X+83 215(r=0.999 8)，表明沙利度胺浓度在40.32～141.12 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5精密度试验精密吸取沙利度胺对照品溶液(0.10 mg/mL)10 μL，按“2.3.1”项下的色谱条件进行测定，重复进样6次，每次10 μL，记录峰面积，并计算其RSD为0.04%，表明仪器精密度良好。

2.3.6稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μL于0、2、4、6、8、10、12 h按照“2.3.1”项下的色谱条件，分别进样测定，记录峰面积，计算其RSD为0.26%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.7重复性试验取同一批红净胶囊(批号：140915)，按照“2.3.2”项下的方法制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，结果显示沙利度胺的平均含量为129.63 mg/g，RSD为1.15%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.3.8加样回收率试验分别称取约35 mg已知含量(每克含有沙利度胺约25 mg)的红净胶囊内容物9份，精密称定，分别按照高、中、低浓度加入一定量的沙利度胺对照品，混合均匀，置10 mL量瓶中，加乙腈适量，超声30 min，取出，放冷，加乙腈定容至刻度。精密量取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取10 μL，按照“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.3.9样品含量测定精密称取3批红净胶囊内容物，按照“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按照“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，并计算沙利度胺的含量，结果见表2。

表1　加样回收率实验结果(n=9)

表2　三批样品沙利度胺的含量测定结果

3　讨论

笔者在显微鉴别中发现，三七的树脂道在药材中稀少而在制剂中并未发现，因此未把三七的树脂道鉴别纳入标准。此外，本制剂中三七和冰片的鉴别，同时采用了显微鉴别法和薄层色谱鉴别法，结合两者独特的显微结构和薄层色谱图，判断制剂中有三七和冰片的存在，较为科学合理。

薄层色谱法中制备丹参供试品溶液时，通过查阅相关文献[7-9]，考查了几种不同的提取方法：加乙醚，振摇，放置1 h；加乙醚超声30 min；加乙醚超声10 min；加乙醚超声5 min；结果发现效果无明显差异，最终选择了最简便易行的方法即加乙醚超声5 min。

本制剂的定性鉴别中均以各自的阴性对照进行对照实验，结果显示无干扰，且方法专属性强，灵敏度高，重现性好，将丹参酮ⅡA和冰片使用同一供试品和展开系统，简化了操作，效果较好，可以纳入该制剂的质量标准。

三七的薄层色谱鉴别中，通过查阅药典[10]和相关文献[11-18]，分别考查了几种不同的展开系统，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置12 h的下层溶液、三氯甲烷-甲酸-水-冰醋酸(14∶11∶2∶0.5)、三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液、三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下层溶液，结果发现，在三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下层溶液的展开系统中，薄层色谱能呈现斑点整齐、清晰，且Rf值适中的效果，故选择此展开系统。

沙利度胺为本方的主药，故笔者在本质量标准研究中建立了沙利度胺的含量测定方法。通过本实验建立的薄层鉴别方法和高效液相色谱含量测定方法对三批样品进行质量控制，发现本方法简便易行，灵敏度高，重现性好，可用于红净胶囊的质量控制。

参考文献：

[1]陆前进，张建中，邓丹琪.红斑狼疮：从基础到临床[M].北京：北京大学医学出版社，2013:3.

[2]夏嘉，江春春，苏晓，等.系统性红斑狼疮中医病因病机及辩证分型的研究进展[J].医学综述，2015，21(3)：500-502.

[3]李开平.系统性红斑狼疮临床治疗新进展[J].中国社区医师，2015，31(7)：9-10.

[4]张传文.系统性红斑狼疮发病机制的研究进展[J].医学信息，2011,(7)：3165-3166.

[5]邱娟.HPLC法测定沙利度胺片中沙利度胺的含量[J].天津药学，2011，23(3)：16-17.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：372-373.

[7]卢佶，李兆奎.强骨胶囊的薄层色谱鉴别[J].浙江中医杂志，2014，49(5)：386.

[8]陈海滨，池文杰.桃仁通痹丸的质量标准研究[J].海峡药学，2014，26(3)：15-17.

[9]古海锋，李岳，厉进忠，等.养心安神丸定性定量方法的研究[J].药物分析杂志，2014，34(6)：1125-1129.

[10]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010：11.

[11]史亚军，唐志书，宋忠兴.复方三七滴丸薄层色谱鉴别研究[J].中国现代药物应用，2009，3(1)：13-14.

[12]梁香.降脂通脉胶囊的薄层鉴别[J].中国现代药物应用，2012，6(1)：78.

[13]徐金凤，孙妍，张洪娟.续断接骨丸制剂工艺和质量标准薄层鉴别方法的研究[J].黑龙江中医药，2014,(3)：47-48.

[14]阿古拉，刘百羽，刘林.复方三七止血药纸的质量控制研究[J].现代中药研究与实践，2013，27(5)：52-54.

[15]卓斌，曾聪彦，钟希文.解毒醒脑合剂的薄层鉴别研究[J].世界中西医结合杂志，2009，4(6)：404-405.

[16]吴静澜，郭璐玫.三七总皂苷凝胶膏剂质量标准研究[J].贵阳中医学院学报，2014，36(2)：136-137.

[17]王明科，张丽华.三七丹参颗粒指纹鉴定研究[J].中国医药科学，2011，1(5)：35-37.

[18]胡宝江.冠心丹参滴丸鉴别技术分析[J].科技博览，2014,(10):345.

收稿日期：2015-04-16

基金项目：口腔专科特色非标准制剂标准提高研究(14ZJZ06)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603020

Quality standard of Hongjing capsule

KANG Yu-xia1,2,LEI Wan2,WANG Ying2,GUO Fei-yan2,WANG Xiao-juan2*

(1.College of Pharmacy,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China; 2.State Key Laboratory of Military Stomatology,Desect1ment of Pharmacy,School of Stomatology,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the quality standard of Hongjing capsule.MethodsBorneol and radix notoginseng from Hongjing capsule were identified by microscopic identification; Salvia miltiorrhiza,borneol and radix notoginseng were identified qualitatively by TLC; HPLC was adopted to determine the content of thalidomide in the preparation,chromatographic column was Inertsustain C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (15∶85,v/v)was as mobile phase,and detection wavelength was at 237 nm.ResultsUnder the condition of selected TLC,the spot color was clear and the separation effect was good.Thalidomide showed a good linear relationship in the range of 40.32～141.12 μg/mL with r=0.999 8,and average recovery was 98.27% with RSD 1.44% (n=9).ConclusionThe method is simple and specific with good repeatability and can be used for quality control of Hongjing capsule.

Key words：Hongjing capsule; TLC; HPLC; Thalidomide