葫芦素B 通过激活线粒体途径诱导人肺癌NCI-H460 细胞凋亡

张　萌，边志刚，何　平*



葫芦素B 通过激活线粒体途径诱导人肺癌NCI-H460 细胞凋亡

张萌a，边志刚b，何平a*

中国医科大学附属盛京医院 a.干诊科，b.鼻科，沈阳 110004

[摘要]目的探讨葫芦素B 对人肺癌NCI-H460 细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其机制。方法体外培养NCI-H460 细胞，MTT 法观察葫芦素B 对细胞增殖的影响，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。采用罗丹明123(Rhodamine 123)染色，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm)，采用Western blot 方法检测线粒体内和胞浆内的细胞色素C。结果葫芦素B 对NCI-H460 细胞的增殖有抑制作用，且呈剂量、时间依赖性；葫芦素B 处理组细胞形态发生显著改变，细胞皱缩、变圆，可见胞核染色质浓缩；流式细胞仪检测结果显示葫芦素B 诱导NCI-H460 细胞凋亡，呈剂量依赖性。葫芦素B 处理后线粒体膜电位显著下降，细胞色素C 由线粒体释放到胞浆中。结论葫芦素B 可以抑制人肺癌NCI-H460 细胞的增殖并诱导细胞凋亡，线粒体途径参与葫芦素B 诱导的NCI-H460 细胞凋亡。

[关键词]葫芦素B；肺癌；凋亡；线粒体途径

0　引言

肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重危害人类的健康和生命。我国肺癌发病率已经位居恶性肿瘤发病率的首位。探明肺癌发生、发展的分子机制，寻找有效的治疗手段，是亟待解决的难题和挑战。

随着多药耐药的提出，在全世界范围内，抗癌药物的研究已逐渐转向天然动物和植物，我国传统的中医中药越来越受到人们的青睐，单味中药及其有效成分或复方制剂诱导肿瘤细胞凋亡的研究已成为近年来肿瘤研究的一个热点。葫芦素B (Cucurbitacin B，CuB )是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员。在上世纪70～80 年代，我国就已研发出葫芦素片(主要成分为葫芦素B 和葫芦素E)，作为原发性肝癌和肝炎的辅助治疗药物[1]。近年来，大量的研究表明，小剂量的葫芦素B对喉癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞的生长也具有抑制作用[2-11]，但具体机制尚存在争议，有待进一步研究。本研究就葫芦素B 对人肺癌细胞系NCI-H460 细胞株的影响及可能的分子机制进行探讨，以期为肺癌的治疗提供新的药物和理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂人肺癌NCI-H460 细胞由北京协和医学院肿瘤实验室惠赠；葫芦素B 购自中国药品生物制品检定所；胎牛血清购自天津灏洋生物公司；RPMI-1640 培养基购自 GIBCO 公司；0.25% 胰蛋白酶购自以色列 Biological Industries 公司；四甲基偶氮唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)及罗丹明123 购自美国 Sigma 公司；Annexin V/PI 双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；线粒体/胞浆蛋白提取试剂购自 BioVision 公司；BCA 法蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；β-actin、细胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)抗体购自 Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自武汉博士德生物工程公司；增强化学发光试剂盒购自 Thermo Scientific Pierce 公司。

1.2细胞培养用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基培养细胞，在37 ℃、饱和湿度、二氧化碳浓度为5% 的培养箱中进行细胞培养。NCI-H460 细胞呈单层贴壁生长，每2～3 天传代1 次。选取对数生长期细胞进行实验。

1.3MTT 法检测细胞增殖将消化收集好的NCI-H460 细胞调整成浓度为1×105/mL 的细胞悬液，100 μL/孔接种于96 孔细胞培养板，过夜贴壁后，依次加入含不同浓度葫芦素B 的培养液，使其终浓度分别为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 μmol/L，同时设空白对照组和阴性对照组，每组设3 个平行孔，继续培养24、48 或72 h。每孔加入20 μL 的MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h后小心吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡混匀10 min。酶标仪(波长570 nm) 检测每孔光密度值(OD值)。增殖抑制率按如下公式计算：抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次。

1.4倒置显微镜下观察细胞形态将对数生长期细胞分别加入含0.5、5 μmol/L 葫芦素B 的培养液，对照组加相同容积的培养液，继续培养24 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡率将NCI-H460 细胞5×105个/孔接种于6孔培养板中，过夜待细胞贴壁后，加入含不同浓度葫芦素B 的培养液，使其浓度分别为0.5、5 μmol/L，并设空白对照组，继续培养24 h。消化，收集细胞后，用500 μL 1×Binding Buffer 悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，AnnexinV-FITC、PI 双染细胞，室温避光孵育15 min后上机检测。实验重复3 次。

1.6线粒体膜电位的检测将NCI-H460 细胞5×105个/孔接种于6 孔培养板中过夜，加入终浓度为0.5、5 μmol/L的葫芦素B 溶液，并设空白对照组(加等量RPMI-1640 培养基)和阴性对照组。继续培养24 h，将上清和消化下来的细胞收集到15 mL的离心管中，2 000 转/min离心10 min，用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS) 再洗涤1次并相同条件离心。弃上清，用1 mL PBS重悬细胞，加入罗丹明123 染液5 μL(浓度为10 mg/mL)置于细胞培养箱孵育30 min。PBS离心洗涤细胞2 次(2 000 转/min，10 min)，弃上清，1 mL PBS 重悬细胞。流式细胞仪分析。用ModFit 专业软件获取分析数据。实验重复3 次。

1.7Western blot 检测葫芦素B 对NCI-H460 细胞Cyt C 表达的影响将对数生长期的NCI-H460 细胞接种于75 cm2培养瓶中，生长24 h后加入含0.5、5 μmol/L 葫芦素B 的培养液继续培养24 h。加等量RPMI-1640 培养基作为阴性对照。裂解细胞，分别提取细胞浆和线粒体中的细胞蛋白，测定并调整蛋白浓度。样品与2 倍浓度的上样缓冲液以1∶1 的体积比混合，95 ℃ 变性5 min，室温冷却后40 μg/孔上样，行SDS-PAGE 电泳，电泳结束后湿法转膜，5% 脱脂奶粉(TBST 配制)室温封闭1 h，洗膜后加入1∶500 稀释的一抗(Cytochrome C、β-actin)，4 ℃ 孵育过夜，洗膜后加入1∶2 000 稀释的辣根过氧化物酶结合的相应二抗，常温孵育1 h。增强化学发光显影，UVI凝胶成像系统检测蛋白表达情况。

2　结果

2.1葫芦素B 抑制NCI-H460 细胞增殖MTT 检测结果显示，葫芦素B 使NCI-H460 细胞的增殖水平明显受到抑制。随着药物浓度的增大及作用时间的延长，葫芦素B 对NCI-H460 细胞的增殖抑制作用逐渐增强，表明葫芦素B 对NCI-H460 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间均有显著性差异(P<0.05)，见图1。

图1　葫芦素B 对NCI-H460 细胞的增殖抑制作用(MTT法)

2.2葫芦素B 诱导NCI-H460 细胞形态改变在倒置相差显微镜下观察，对照组细胞在培养24 h后，细胞密度明显增大，形成致密贴壁的卵圆形或多角形细胞。细胞伸展性好，细胞质均匀，核大、核仁清楚。葫芦素B 作用后的NCI-H460 细胞形态发生了明显变化，经0.5 μmol/L 葫芦素B 作用24 h的细胞，细胞密度降低，细胞皱缩、变圆，胞核染色质浓缩。经5 μmol/L 葫芦素B 处理24 h的细胞全部皱缩变圆，大量细胞脱落、死亡，漂浮于培养液中，见图2。

图2　倒置相差显微镜观察NCI-H460 细胞形态(×100)

2.3流式细胞术检测细胞凋亡Annexin V/PI 双染流式细胞仪检测结果显示，0.5、5 μmol/L的葫芦素B 可以诱导NCI-H460 细胞凋亡，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。随着药物浓度的增大，早期凋亡和晚期凋亡的细胞都逐渐增多，呈现剂量-效应关系，见图3。

图3　流式细胞术检测CuB 对NCI-H460 细胞凋亡的影响

2.4葫芦素B 对NCI-H460 细胞线粒体膜电位△ψm 的影响0.5、5 μmol/L 葫芦素B 处理NCI-H460 细胞24 h后，细胞的线粒体膜电位△ψm 峰值下降，△ψm 峰出现有意义的向左移的趋势，分布在去极化区域的细胞增多，由对照组的(3.18±0.98)%升高到(15.18±1.45)%和(30.32±1.62)%，不同浓度组与对照组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4　葫芦素B 对NCI-H460 细胞线粒体膜电位的影晌

2.5葫芦素B对NCI-H460 细胞Cyt C释放的影响Western blot 方法检测胞浆内及线粒体内的Cyt C，发现葫芦素B 作用于NCI-H460 细胞后，胞浆内Cyt C 逐渐增多，而线粒体内Cyt C 逐渐减少，表明Cyt C 由线粒体释放到胞浆中，随葫芦素B 作用浓度的增加，变化更明显，见图5。

图5　葫芦素B 对NCI-H460 细胞Cyt C 释放的影响

3　讨论

葫芦素B 是提取自葫芦科及多种其他科属植物的葫芦素成分之一，具有多种生物活性，近年来的研究表明，葫芦素B 能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，其抗肿瘤作用逐渐成为研究的热点。本研究用不同浓度的葫芦素B 处理人肺癌NCI-H460 细胞一定时间后，用MTT 比色法检测细胞增殖，结果显示，葫芦素B 对NCI-H460 细胞有明显的增殖抑制作用，其作用呈剂量和时间依赖性(图1)。倒置相差显微镜观察结果表明，葫芦素B 处理使细胞密度降低，细胞皱缩、变圆，胞核染色质浓缩，部分细胞脱落、死亡，漂浮于培养液中(图2)。流式细胞仪检测发现，葫芦素B 作用于NCI-H460 细胞一定时间后，细胞凋亡率明显增加，随着葫芦B 浓度的增加，细胞凋亡率亦增加(图3)。这些结果均提示，葫芦素B 作用于肺癌细胞后，细胞增殖受到抑制，加之细胞凋亡增加，肿瘤生长受到抑制。

一般认为，肿瘤的发生不仅是细胞异常增殖和分化的结果，也与细胞凋亡的异常有关，是细胞的凋亡机制受到抑制，机体不能及时清除体内过多的、受损伤的或恶变的细胞的结果。研究表明，线粒体在细胞凋亡过程中发挥着中心调控的重要作用，线粒体功能的障碍可导致哺乳动物细胞出现衰老和凋亡，与多种疾病的发生有关[12-16]。保护线粒体功能的完好可以抑制细胞凋亡的发生[17]。大量证据表明，凋亡细胞在产生特征性的形态学变化和DNA 降解之前，线粒体的形态和功能就已经发生了变化，线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。当凋亡程序的开始信号到达线粒体后，线粒体膜肿胀，膜通透性增高，导致线粒体膜两侧质子和离子的不对称分布消失，从而导致线粒体膜电位下降，线粒体功能紊乱，Cyt C 等各种促凋亡蛋白被释放到胞浆中。当Cyt C 与凋亡蛋白激活因子1 相结合后，募集并激活Caspase-9，再促使下游的凋亡效应因子Caspase-3 等活化，最终触发Caspase 介导的凋亡级联反应[18]，导致细胞凋亡。

我们检测了葫芦素B 作用后NCI-H460 细胞线粒体膜电位的变化，发现随着药物作用剂量的增加，线粒体膜电位水平△ψm 峰值下降，△ψm 峰出现有意义的向左移的趋势。Cyt C 的检测发现，随着葫芦素B 药物浓度的增加，线粒体内Cyt C 减少，而胞浆内Cyt C 逐渐增多，即Cyt C 从线粒体释放入胞浆中。表明葫芦素B可能通过导致细胞线粒体膜电位的下降，使线粒体内Cyt C 释放到胞浆中，进而引起Caspase 激活，最终导致细胞凋亡。葫芦素B 通过激活细胞凋亡的线粒体途径诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的一个重要机制。

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收稿日期：2015-12-20

基金项目：盛京医院院内课题(MD55)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603002

Cucurbitacin B induces apoptosis of NCI-H460 lung cancer cells through activation of mitochondrial pathway

ZHANG Menga,BIAN Zhi-gangb,HE Pinga*

(a.Desect1ment of Geriatrics Medicine,b.Desect1ment of Rhinology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of Cucurbitacin B on the proliferation and apoptosis of NCI-H460 lung cancer cells and investigate the mechanism.MethodsThe NCI-H460 cells were cultured in vitro.The growth inhibitory effect of Cucurbitacin B on NCI-H460 cells was detected by MTT assay.The morphological changes were observed under inverted microscope.Apoptosis rate was determined by flow cytometry analysis.The mitochondrial membrane potential (Δψm) was detected by flow cytometry following rhodamine 123 staining.The expression of mitochondrial cytochrome C and cystolic cytochrome C was determined by Western blot.ResultsThe growth of NCI-H460 cells was inhibited by Cucurbitacin B in a dose-and time-dependent manner.Marked morphological changes such as cell volume shrinking and chromatin condensation were observed after treatment by Cucurbitacin B.Flow cytometry analysis showed that Cucurbitacin B could induce NCI-H460 cells apoptosis in a dose-dependent manner.Cucurbitacin B treatment induced significant disruption of △ψm.Cytochrome C was released from mitochondria to cytoplasm.ConclusionCucurbitacin B could inhibit the growth of NCI-H460 lung cancer cells and induce cell apoptosis through activation of mitochondrial pathway.

Key words：Cucurbitacin B；Lung cancer；Apoptosis；Mitochondrial pathway