CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在牛奶蛋白过敏发生及耐受中的作用

杨希晨，刘　静，华亚军

(东南大学医学院附属江阴市人民医院儿科，江苏 江阴 214400)



【医学荟萃】

CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在牛奶蛋白过敏发生及耐受中的作用

杨希晨，刘静，华亚军

(东南大学医学院附属江阴市人民医院儿科，江苏 江阴 214400)

[摘要]目的探讨CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在牛奶蛋白过敏患儿发病及耐受过程中的作用。方法选取2013年1月至2015年1月东南大学医学院附属江阴市人民医院儿科明确诊断牛奶蛋白过敏的患儿20例，健康对照组20例，牛奶蛋白过敏患儿予深度水解或完全水解蛋白配方粉喂养6个月，6个月后行食物激发试验，过敏耐受者15例，耐受失败者3例。治疗前后测定外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的水平，分析比较牛奶蛋白过敏患儿治疗前、治疗后及与对照组之间CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的差异，并比较治疗后过敏耐受患儿和耐受失败患儿CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的差异。结果牛奶蛋白过敏患儿CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞水平明显低于对照组患儿(3.73±0.42% vs 6.90±0.35%，t=2.22，P<0.05)；治疗后CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞水平较治疗前明显升高(5.18±0.81% vs 3.73±0.42%，t=2.10，P<0.05)；治疗后牛奶蛋白耐受患儿CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞水平明显高于耐受失败患儿(5.36±0.76% vs 4.28±0.36%，t=2.31，P<0.05)。结论CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞有助于减少牛奶蛋白过敏的发生，并帮助诱导免疫耐受。

[关键词]牛奶蛋白过敏；CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞；儿童；免疫耐受

近年来，随着生活方式及环境的改变，过敏性疾病发病率逐年提高。牛奶蛋白过敏是婴儿最常见的过敏性疾病，在欧美发达国家，婴儿牛奶过敏发生率为1.2%～17%[1]。我国目前无确切的统计学数据，但临床发现该类疾病患儿越来越多，对儿童的生活质量及生长发育有严重影响。

牛奶蛋白过敏(cow’s milk allergy, CMA)的发病复杂，多种免疫细胞、活性因子参与调控，机制尚不完全清楚。近年来多方面动物实验研究提示调节性T细胞(regulatory T cells, Treg细胞)尤其是表达FOXP3的调节性T细胞在过敏反应的发生及过敏耐受过程中有重要作用[2-3]。本文通过检测牛奶蛋白过敏患儿发病时及耐受后外周血CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+Treg)的水平，说明CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在该病发病及耐受过程中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1月至2015年1月江阴市人民医院儿科门诊及病房临床拟诊为牛奶蛋白过敏患儿25例，诊断基本符合2009年11月中华医学会儿科学分会免疫学组《中华儿科杂志》编辑委员会提出的《婴儿过敏性疾病预防、诊断和治疗专家共识》[4]，并排除其他过敏性疾病可能。拟诊牛奶蛋白过敏的患儿回避完整的牛奶蛋白饮食，予深度水解或完全水解蛋白配方粉喂养2周，症状无改善者剔除实验组。症状改善或消失者行诊断性食物激发试验(1周时间观察)，如症状反复，激发试验阳性，则明确诊断为牛奶蛋白过敏患儿，并纳入实验组，共20例，其中男12例，女8例，平均月龄4.09±2.10。其他5例剔除实验组，考虑其他诊断。随访20例明确诊断牛奶蛋白过敏患儿6个月，2名患儿治疗过程中失访，其他18名儿童6个月后再次行食物激发试验，试验阴性为过敏耐受，共15例，试验阳性考虑耐受失败，共3例。

健康对照组20例，均为本院同期体检的健康婴儿，无过敏性疾病病史及家族史，无急慢性疾病，生长发育良好，男10例，女10例，平均月龄4.86±2.29，与实验组在性别分布、年龄上均无明显差异(χ2=0.43，P>0.05；t=1.125，P>0.05)。

1.2方法

CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞水平测定：所有参与研究婴儿均清晨6:00空腹采取静脉EDTA抗凝血2mL，EDTA抗凝静脉血以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，采用CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞试剂盒(购自美国eBbioscience公司)及流式细胞术测定(FACScan流式细胞仪，美国BD公司)CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在CD4+T细胞中的百分比。

1.3统计学方法

流式数据以CD4+CD25+FOXP3+T淋巴细胞在CD4+T淋巴细胞中的百分比表示。运用SPSS 13.0统计学软件分析数据，t检验两组均数的差异，卡方检验比较两组率的差异，其中以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1临床表现

20例明确诊断牛奶蛋白过敏患儿中8例患儿有明确的过敏性家族史，14例有湿疹的表现，8例表现为消化道症状，其中3例有呕血，4例有便血，多为大便含血丝。治疗随访6个月后2名患儿失访，余患儿消化道症状均消失，湿疹情况明显改善，其中12例湿疹症状消失，仅2例患儿仍有轻度的湿疹反复。该18例患儿中无喘息、过敏性休克及营养不良病例。

2.2实验组治疗前、治疗后及与对照组之间CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞数量比较

实验组治疗前与对照组相比有显著性差异(t=2.22，P=0.042)；实验组治疗前后相比有显著性差异(t=2.10，P=0.048)，见表1。

2.3耐受组与耐受失败组患儿在治疗后CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞数量比较

实验组治疗后6个月行食物激发试验，其中过敏耐受者15例，耐受失败者3例。过敏耐受组与耐受失败组外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg数量比较存在显著性差异(t=2.31，P=0.031)，见表2。

Table 1　Comparison of the level of CD4+CD25+FOXP3+　regulatory T cells in peripheral blood among children in different ±S)

Table 2　Comparison of the level of CD4+CD25+FOXP3+ 　regulatory T cells in peripheral blood after treatment among children in different groups ±S)

3讨论

3.1牛奶蛋白过敏

过敏性疾病发病率呈全球性增长趋势，已成为新世纪的流行病，是全球性健康问题。食物过敏是一种多因素、多系统参与的由遗传背景和环境因素共同作用导致的复杂疾病，是一种较常见的变应性疾病[1]。牛奶是婴儿除母乳以外最早接触的食物，因此牛奶蛋白过敏为婴幼儿最常见也是最早出现的食物过敏，临床表现可累及多个系统，表现多种多样，累及消化系统表现为：呕吐、腹泻、胃食道反流、便血、便秘；累及皮肤表现为荨麻疹、湿疹、面部、口唇、眼睑水肿，重者可表现为缺铁性贫血、生长发育落后、低蛋白血症，影响患儿的生长发育。本研究中亦发现牛奶蛋白过敏多发病于小婴儿，以湿疹症状最为常见，其次为消化道症状，通过食物回避后消化道症状及皮肤表现均可明显改善，与以往研究一致[5]。

3.2治疗前后不同组中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞水平差异意义及作用机制

本研究提示，牛奶蛋白过敏组患儿治疗前外周血中CD4+CD25+FOXP3+Tregs数量明显少于对照组患儿，治疗后外周血中CD4+CD25+FOXP3+Tregs数量较治疗前升高，6个月后牛奶蛋白耐受失败患儿体内CD4+CD25+FOXP3+Treg明显少于耐受成功患儿，证实CD4+CD25+FOXP3+Tregs有助于减少过敏的发生，并帮助诱导免疫耐受，提示CD4+CD25+Treg与过敏性疾病及免疫耐受存在相关性，提示CD4+CD25+Treg可通过抑制效应T细胞来诱导口服耐受，实现对免疫应答的负调节。

既往的体外实验表明外周和肠道局部的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Treg 细胞)在形成食物耐受中发挥重要作用[2]。CD4+CD25+Treg是胸腺产生的功能成熟的T细胞亚群，约占外周血CD4+T细胞的5%～10%，是Treg细胞的主要组成部分。CD4+CD25+调节性T细胞具有免疫无能性，在接受抗原刺激后既不增生也无白细胞介素-2(IL-2)分泌等T细胞活化现象；同时，CD4+CD25+Treg具有免疫抑制性，可抑制其他CD4+和CD8+T细胞亚群及B细胞的活化和细胞因子的分泌。其通用细胞间接触性抑制、分泌细胞因子、旁观者效应等方式发挥免疫抑制效应[6]。其中转录因子Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞发育和功能维持的关键性调节基因，其对于其他调节性T细胞的发育也有着重要的作用。Foxp3基因缺失使CD4+CD25+Tregs抑制活性消失，而Foxp3在CD25+Treg异位表达则可恢复抑制活性。Foxp3基因突变小鼠出现高过敏状态，提示调节性T细胞数目或功能异常可能在过敏的发病中起到一定的作用[7]。

3.3其他过敏性疾病中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞

CD4+CD25+FOXP3+Tregs除了在食物过敏的发生及耐受过程中起到重要作用以外，在其他过敏性疾病中亦发挥着重要作用。2007年Hartl等的研究表明哮喘儿童肺泡灌洗液中CD4+CD25+Treg值是下降的，其吸入糖皮质激素与外周血和肺泡灌洗液中CD4+CD25+Treg比例上升有相关性。另外国内王炜等2013年研究发现哮喘急性发作期患儿CD4+CD25+Treg的数量、Foxp3基因表达与缓解期的儿童相比，数量减少，表达降低，提示调节性T细胞数量减少及分化障碍可能在儿童哮喘的发病中亦起重要作用。

综上所述，CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在牛奶蛋白过敏患儿的发病及过敏耐受过程中有着重要作用，它有助于减少过敏的发生，并帮助诱导免疫耐受，但具体的免疫调节机制尚有待于进一步研究。

[参考文献]

[1]Umasunthar T, Leonardi-Bee J, Turner P J,etal. Incidence of food anaphylaxis in people with food allergy: a systematic review and meta-analysis [J]. Clin Exp Allergy, 2015,45(11):1621-1636.

[2]Van den Elsen L W, Meulenbroek L A, van Esch B C,etal.CD25+regulatory T cells transfer n-3 long chain polyunsaturated fatty acids-induced tolerance in mice allergic to cow’s milk protein [J].Allergy,2013,68(12):1562-1570.

[3]Barletta B, Rossi G, Schiavi E,etal.Probiotic VSL#3-induced TGF-β ameliorates food allergy inflammation in a mouse model of peanut sensitization through the induction of regulatory T cells in the gut mucosa[J]. Mol Nutr Food Res, 2013,57(12):2233-2244.

[4]中华医学会儿科分会免疫学组.婴儿过敏性疾病预防、诊断和治疗专家共识[J].中华儿科杂志,2009,47(11):835-838.

[5]郑玉灿,金玉,李玫,等.游离氨基酸配方奶粉在牛奶蛋白过敏患儿中的应用[J].实用儿科临床杂志,2012,27(19):1488-1490.

[6]Palomares O.The role of regulatory T cells in IgE-mediated food allergy[J].J Investig Allergol Clin Immunol,2013,23(6):371-382.

[7]Sakaguchi S.Regulatory T cells: history and perspective[J].Methods Mol Biol,2011,707:3-17.

[专业责任编辑：史晓薇]

[收稿日期]2015-12-30

[作者简介]杨希晨(1983-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事儿童消化系统疾病及儿童重症诊疗工作。

[通讯作者]华亚军，主任医师。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.024

[中图分类号]R725.7

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5293(2016)07-0859-02

Roles of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in pathogenesis and tolerance for cow’s milk allergy

YANG Xi-chen, LIU Jing, HUA Ya-jun

(Department of Pediatrics, Jiangyin People’s Hospital Affiliated to Southeast University Medical College,Jiangsu Jiangyin 214400, China)

[Abstract]Objective To explore the roles of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in the pathogenesis of and tolerance induction against cow’s milk allergy. Methods A total of 20 children who were allergic to cow’s milk were chosen as research objects. All these children were diagnosed at the department of pediatrics in Jiangyin People’s Hospital Affiliated to Southeast University Medical College from January 2013 to January 2015. Over the same period, 20 healthy children were selected in control group. Children with cow’s milk allergy were given completely hydrolyzed or deeply hydrolyzed protein formulas for six months. Six months later, a food challenge test was performed. Among them, 15 children were tolerant to cow’s milk while 3 children were not. Levels of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in peripheral blood were measured before and after treatment. Besides, comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in children with cow’s milk allergy before and after the treatment was carried out. In addition, intergroup comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was conducted. Moreover, comparison of the CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was also performed between children who developed tolerance to cow’s milk and who were still allergic to cow’s milk. Results The level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was significantly lower in children with cow’s milk allergy than the control group (3.73±0.42% vs 6.9±0.35%, t=2.22, P<0.05). After treatment, a remarkable increase was identified in the level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells when compared with the situation before treatment (5.18±0.81% vs 3.73±0.42%, t=2.10, P<0.05). After treatment, the level of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells was significantly higher in children who developed tolerance to cow’s milk than those who were still allergic to cow’s milk (5.36±0.76% vs 4.28±0.36%,t=2.31,P<0.05).Conclusion CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells can help to reduce the incidence of allergy to cow’s milk protein and help to trigger immune tolerance.

[Key words]cow’s milk allergy; CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells; children; immune tolerance