加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血痴呆大鼠VEGF表达和微血管密度的影响

庞小刚，毕春玉，于华芸，武　冰，吴智春，王志宏

(山东中医药大学，山东 济南 250355)



加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血痴呆大鼠VEGF表达和微血管密度的影响

庞小刚，毕春玉，于华芸，武冰，吴智春，王志宏

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

[摘要]目的观察加味孔圣枕中丹对慢性脑缺血致血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆能力及脑血管内皮生长因子(VEGF)表达和微血管密度(MVD)的影响，探讨该方影响血管生成、改善学习记忆能力的可能机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、加味孔圣枕中丹组和贝伐单抗组，除假手术组外，其余组均采用双侧颈总动脉永久结扎法建立慢性脑缺血痴呆大鼠模型。造模24 h后，加味孔圣枕中丹组及贝伐单抗组均给予加味孔圣枕中丹水煎浓缩液16 mL/(kg·d)灌胃，模型组和假手术组给予等容量生理盐水灌胃，均1次/d，连续30 d。贝伐单抗组另给予贝伐珠单抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。干预结束后，Morris水迷宫检测各组大鼠逃避潜伏期评价学习记忆能力，免疫组化法检测皮质及胼胝体VEGF和CD34表达情况，以CD34标记MVD。结果与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，胼胝体VEGF表达水平升高(P<0.05)，皮质和胼胝体MVD显著升高(P均<0.05)；与模型组比较，加味孔圣枕中丹组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)，皮质及胼胝体VEGF表达水平、MVD均显著升高(P均<0.05)；与贝伐单抗组比较，加味孔圣枕中丹组皮质VEGF表达水平及MVD均显著升高(P均<0.05)。结论加味孔圣枕中丹能上调慢性脑缺血大鼠脑组织VEGF表达，促进脑组织血管生成，这可能是其改善痴呆模型大鼠学习记忆能力的作用机制之一。

[关键词]加味孔圣枕中丹；血管性痴呆；血管内皮生长因子；微血管密度

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是脑血管病后的主要并发症，是以健忘、呆笨为主要临床表现的一种脑功能衰退性疾病[1]。随着人口老龄化及脑血管病发病率增长，VD将会成为全球第一大痴呆类型[2]，严重威胁人类身心健康。慢性脑缺血是VD 发生的重要病理学基础，慢性持续性脑血流量下降使大脑参与认知的重要部位如额、颞叶皮质，海马以及白质区等长期处于缺血状态，逐渐出现认知功能障碍[3-4]，改善和恢复局部的血供可能是治疗本病的有效手段。加味孔圣枕中丹方由龟板、山茱萸、川芎等组成，功可补肾活血开窍，前期研究发现其对VD大鼠脑细胞具有一定保护作用[5]。本次研究拟建立慢性脑缺血VD大鼠模型，观察其对VD大鼠皮质及胼胝体血管内皮生长因子(VEGF)表达及微血管密度(MVD)的影响，进一步探究其可能机制。

1实验资料

1.1实验动物雄性SD大鼠40只，体质量(250±10)g，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要药物贝伐珠单抗注射液购自瑞士罗氏制药公司。加味孔圣枕中丹由山东中医药大学附属医院药剂科负责煎制，每毫升含龟板0.33 g、生龙骨0.33 g、山茱萸0.28 g、肉苁蓉0.22 g、石菖蒲0.17 g、远志0.17 g、丹参0.28 g、川芎0.22 g。

1.3主要试剂与仪器VEGF单克隆抗体(Lot.GR58038-1)和CD34单克隆抗体(lot. GR55967-1)购自英国ABCAM公司。浓缩型DAB试剂盒(Lot.15111A03)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics 公司)，LEICARASP300全自动脱水机(德国徕卡公司)，OLYMPUS CX41光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4实验方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、加味孔圣枕中丹组、加味孔圣枕中丹加贝伐珠单抗组(简称贝伐单抗组)，每组10只，4组大鼠饲养环境相同。除假手术组外，其余组大鼠均采用双侧颈总动脉永久结扎法(2-VO)建立VD大鼠模型[6]：4%水合氯醛6.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部常规备毛、消毒，颈部中线正中切开，分离双侧颈总动脉，无菌丝线双结扎，剪断颈总动脉。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不结扎剪断。逐层缝合伤口，外敷少许青霉素钠。模型制备24 h后，加味孔圣枕中丹组及贝伐单抗组均给予加味孔圣枕中丹水煎浓缩液16 mL/(kg·d)灌胃，模型组和假手术组给予等容量生理盐水灌胃，均1次/d，连续30 d。贝伐单抗组另给予贝伐珠单抗注射液2 mg/kg腹腔注射，1次/2周。

1.5观察指标

1.5.1Morris水迷宫逃避潜伏期干预结束后进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫装置参照文献[7]，选用大鼠通用型圆桶，在圆桶上缘设等距离的东、西、南、北4个标记点，将水面和水桶分成4个象限。实验时向水桶加水至37 cm，水温控制在23～25 ℃，水内添加墨汁，使其呈黑色不透明状。先将大鼠放入水池中进行自由游泳训练2 min，使其熟悉环境。实验共历时4 d，每天定于固定时间段，每个时间段训练4次。实验时，将高度为35 cm、直径为8 cm的平台设置于东北象限，将大鼠先由远离平台的西南象限入水[8]，然后分别由其他3个象限入水，至其找到平台，记录其逃避潜伏期，并在台上停留2 min。如果2 min未能找到，则将实验动物放在平台上2 min，潜伏期记录为120 s。每日以大鼠4次训练潜伏期的平均值作为大鼠当日的学习成绩。

1.5.2皮质及胼胝体VEGF及CD34表达情况Morris水迷宫实验结束后，麻醉大鼠取脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制片，常规脱蜡及抗原修复，按试剂盒说明书逐步进行免疫组化染色，用SABC法。VEGF蛋白在细胞浆表达，阳性细胞可见棕黄色或棕褐色颗粒，Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，400倍镜下，随机取3个视野，测出VEGF阳性反应细胞的积分光密度(IOD)。CD34阳性染色时细胞内有浅棕色至深棕色颗粒沉着，每张染色切片于低倍镜下(×40)寻找3个微血管密集区，随后于高倍镜下(×200)计数5个不同视野中的微血管数，取平均值代表MVD值。

2结果

2.1各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期比较随着大鼠学习次数的增加，各组逃避潜伏期逐渐缩短。从第2天开始，模型组大鼠潜伏期明显长于假手术组(P均<0.05)；第3天和第4天，加味孔圣枕中丹组大鼠潜伏期均显著短于模型组(P均<0.05)；加味孔圣枕中丹组和贝伐单抗组各时段潜伏期比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠皮质及胼胝体VEGF表达IOD及MVD比较与假手术组比较，模型组大鼠胼胝体VEGF表达水平明显升高(P<0.05)，皮质和胼胝体MVD显著增加(P均<0.05)；与模型组比较，加味孔圣枕中丹组皮质及胼胝体VEGF表达水平及MVD均显著升高(P均<0.05)；与贝伐单抗组比较，加味孔圣枕中丹组皮质VEGF表达水平及MVD均显著升高(P均<0.05)。见表2。各组皮质及胼胝体VEGF和CD34染色表现见图1及图2。

表2　各组大鼠皮质及胼胝体VEGF表达IOD及MVD比较

注：①与假手术组比较，P<0.05; ②与模型组比较，P<0.05；③与贝伐单抗组比较，P<0.05。

图1　各组大鼠胼胝体及皮质VEGF染色表现(SABC，×400)

图2　各组大鼠胼胝体及皮质CD34染色表现(SABC，×200)

3讨论

慢性脑缺血是多种原因导致长期的脑灌流不足[11]，其引起的能量代谢障碍、离子通道功能失调、神经递质分泌失调以及炎症因子释放等各种损伤因素协同作用，逐渐引起皮质、海马以及大脑白质等与学习记忆密切相关脑组织产生不可逆的损伤[12-13]，导致认知功能障碍。因而改善受损脑组织的血液供应、减轻缺血程度是改善VD临床症状，控制其病情进展的有效手段。长期以来，脑缺血研究多集中在神经元或灰质的损伤反应上，忽视对脑白质损伤的研究。从脑缺血后神经功能恢复的角度来看，所有与缺血有关的脑区、细胞类型和细胞成分都应受到保护，不仅要保护灰质，亦应保护白质。

VD是现今唯一可预防的痴呆类型，早期积极防治病情具有可逆性。本病属祖国医学“痴呆”“呆证”“善忘”等范畴，发病部位在脑，功能物质基础为髓，乃本虚标实之证，肾精亏虚为致病之本[14]，瘀阻窍闭乃致病之标，临证治当补肾益髓、活血开窍[15]。加味孔圣枕中丹是在“补肾益髓”治则指导下，以《备急千金要方》孔圣枕中丹加山茱萸、肉苁蓉、川芎、丹参而成，方中重用龟板为君，补肾、活血，标本兼顾；臣以山茱萸益阴补精，肉苁蓉填精益髓、温助肾阳。君臣相配，阴阳并补，以治肾精亏虚之本。佐以川芎、丹参活血祛瘀；石菖蒲开窍醒神；远志安神定志、益智强识；龙骨镇惊安神。诸药相合，共奏补肾益精、活血开窍之功。补肾填精、温阳益火即可生精益髓，益智健脑，且精气血旺盛，利于活血祛瘀；活血开窍以除病标，使瘀祛窍通，神识自复。本研究中Morris水迷宫实验结果显示，随着大鼠学习次数的增加，各组逃避潜伏期的时间逐渐缩短，表明所有大鼠均具有通过训练学习产生记忆的能力；模型组大鼠逃避潜伏期较假手术组长，而加味孔圣枕中丹组大鼠潜伏期缩短，提示加味孔圣枕中丹能够改善VD大鼠的学习记忆能力。

VEGF作为一种重要的血管发育调节因子，是影响缺血后大脑重塑的重要调控因子之一。脑缺氧缺血后，VEGF表达增高，与其受体结合促进血管内皮细胞增殖, 诱导新生血管的生成[16]，促进侧支循环建立，增加缺血区供血供氧，起直接保护作用[17]。CD34是一种阶段特异性白细胞分化抗原, 选择性地表达于人类造血干细胞、祖细胞和血管内皮细胞表面[18]，是一种与新生小血管相关的抗原，被作为最敏感的新生血管内皮标记物[19]。本实验结果显示，加味孔圣枕中丹组大鼠皮质及胼胝体VEGF表达水平和MVD均显著高于模型组，提示加味孔圣枕中丹可促进VEGF表达，诱导脑血管生成，从而恢复、改善皮质及白质缺血区血供，具有全脑保护效应，这可能是其改善VD大鼠模型学习记忆能力的机制之一。

贝伐单抗是VEGF阻断剂，本实验结果显示，加味孔圣枕中丹和贝伐单抗联合使用组大鼠脑VEGF和MVD与模型组比较差异无统计学意义，与加味孔圣枕中丹组比较皮质VEGF表达水平和MVD则显著降低，提示影响VEGF生物学效应是加味孔圣枕中丹的作用靶点之一。Morris水迷宫实验结果显示，贝伐单抗组逃避潜伏期明显短于模型组，但与加味孔圣枕中丹组比较差异无统计学意义，提示加味孔圣枕中丹改善学习记忆能力的机制除与影响VEGF相关外，可能还有其他方面的机制，有待于进一步探讨。

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[作者简介]庞小刚，男，硕士，讲师，研究方向为中西医结合防治脑血管病药物作用途径及分子机制研究。 [通信作者]王志宏,E-mail:hong62w@126.com

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81202641)；山东省博士后创新项目(201302021)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.003

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)23-2515-04

[收稿日期]2016-04-10

Impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on expression of VEGF and MVD in VD rats induced by chronic cerebral ischemia

PANG Xiaogang，BI Chunyu，YU Huayun,WU Bing, WU Zhichun,WANG Zhihong

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China)

Abstract：Objective It is to observe the impacts of modified Kongshengzhenzhong Pills on the ability of learning and memory，as well as the expression of VEGF protein and the micro vessel density(MVD)in brain tissue of the vascular dementia(VD)rats induced by chronic cerebral ischemia，and to explore the effects of this decoction on angiogenesis and its mechanism of improving learning and memorizing ability. Methods Rat models of VD induced by chronic cerebral ischemia was prepared by bilateral common carotid artery ligation. The experimental animals were randomly divided into sham operation group, model group, modified Kongshengzhenzhong Pills group, and Bevacizumab group. Drug intervention was carried out for 30days.The ability of learning and memorizing of the rats was assessed by Morris water maze experiment. The expression of VEGF protein and CD34 both in cortex and callosum were detected by immunohistochemistry, and MVD was calculated. Results Compared with the sham operation group, the average escape latent period prolonged, the expression of VEGF in callosum, MVD both in cortex and callosum increased in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the average escape latent period shortened, the expression of VEGF and MVD both in cortex and callosum increased significantly in modified Kongshengzhenzhong Pills group(P<0.05).Conclusion Modified Kongshengzhenzhong Pills can elevate the expression of VEGF protein and promote blood vessel formation in brain tissue of VD rats. And these effects may serve as one of its mechanisms of improving learning and memorizing ability of VD rats.

Key wordsmodified Kongshengzhenzhong Pills; vascular dementia; vascular endothelial growth factor; microvessel density