复方苦参注射液对宫颈癌细胞体外放射增敏作用研究

袁选举，王贤和

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心,湖北 十堰 442000)



论著

复方苦参注射液对宫颈癌细胞体外放射增敏作用研究

袁选举，王贤和

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心,湖北 十堰 442000)

[摘要]目的研究复方苦参注射液对人宫颈癌 Hela 细胞株的体外放射增敏作用并初步探讨其作用机制。方法克隆形成法检测放射增敏作用及给药时序、浓度对细胞存活率的影响； DAPI染色法镜下观察细胞凋亡情况；流式细胞法检测细胞周期分布情况；Western blot法检测bcl-2、bax蛋白表达情况。结果复方苦参注射液与射线单独或联合作用后细胞存活率均较单纯放射组明显降低(P均<0.05)，不同浓度、不同时序处理后细胞存活率比较差异有统计学意义,先照射后给药效果优于先给药后照射(P<0.05)；复方苦参注射液与射线均能使Hela细胞阻滞于G2/M期，联用阻滞效果更加显著(P<0.05)；复方苦参注射液与射线均能破坏细胞核，联用后细胞核皱缩、碎裂更加显著；复方苦参注射液与射线单独及联用均能上调bax蛋白表达(P均<0.05)，下调bcl-2蛋白表达(P均<0.05)。结论复方苦参注射液可通过阻滞宫颈癌Hela细胞周期于G2/M期，下调bcl-2/bax的比值来诱导细胞发生凋亡并增强其对放射线的敏感性。

[关键词]复方苦参注射液;宫颈癌;放射增敏

复方苦参注射液是一种广泛应用于临床、具有广谱抗肿瘤作用的中药制剂[1]，其可通过直接杀伤肿瘤细胞及保护机体免疫功能等途径增强调强放疗和腔内后装对宫颈癌患者的放疗疗效并有效减轻放疗毒副反应[2]，对宫颈癌具有较好的应用前景。但目前有关复方苦参注射液在宫颈癌放疗增敏方面的基础研究报道还较少，为此，笔者在细胞水平上对此进行了研究，旨在为其今后能够更好应用于临床提供理论依据。

1实验资料

1.1试剂与仪器复方苦参注射液购自山西振东金晶药业公司,1 mL含生药0.4 g；噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；DAPI购自上海拜力公司；兔抗人bcl-2、bax抗体购自美国Santa Cruz biotechnology公司； Clinac 600C/D加速器(美国Varian公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coluter公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养、传代及照射人宫颈癌Hela细胞株引自本院临床医学研究所，接种于含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素的1640培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次。细胞采用6 MV X射线照射,剂量4 Gy/min，源皮距100 cm。

1.2.2克隆形成法检测放射增敏作用取指数生长期细胞接种于96孔板，分为单放组(A组)、药放1组(照射+20%IC50值)、药放2组(照射+IC50值)，每组设3个平行孔，复方苦参注射液IC50值参照文献[3]取200 μL/mL，照射剂量参照文献[4]取2，4，6，8，12 Gy，单放组与药放组射线剂量相同。药放组又分为先给药后照射、先照射后给药2个亚组即20%IC50复方苦参注射液+照射组、照射+20%IC50复方苦参注射液组、IC50复方苦参注射液+照射组、照射+IC50复方苦参注射液组。先药后照组：复方苦参注射液作用24 h后，单放组和药放组分别接受上述剂量射线照射；先照后药组：细胞经上述剂量射线照射后，药放组加入复方苦参注射液再作用24 h。处理后的细胞均在温箱中孵育10～14 d，固定染色后在倒置显微镜下计数>50个细胞的克隆数，绘制细胞存活曲线并计算细胞克隆形成率和存活率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%；细胞存活率(SF)=受照射克隆形成率(Sx)/对照组克隆形成率(So)。

1.2.3DAPI染色法检测细胞凋亡情况取指数生长期细胞制成单细胞悬液，各取1×105个细胞接种于25 cm3培养瓶中，分为空白组、单放组、单药1组、单药2组、药放1组及药放2组，每组设3个平行孔。射线剂量均为4 Gy，单药1组和药放1组药物浓度为20%IC50值。单药2组和药放2组药物浓度为IC50值，按照1.2.2结果取最佳时序进行照射及给药，PBS洗2次处理完毕的细胞，各孔加入DAPI(5 mg/mL)200 μL，室温避光染色20 min， PBS洗3次，每次5 min，于倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.2.4流式细胞法检测细胞周期细胞分组及处理同1.2.3，收集处理完毕细胞，70%冷乙醇固定后在4 ℃冰箱中过夜，隔日取出重悬细胞，各组加入1 μL RNAase(100 μg/mL)、1 mL PI(50 μg/mL)，避光孵育30 min，流式细胞仪检测， Multicycle软件拟合计算各周期细胞比。

1.2.5Western blot法检测bcl-2、bax蛋白表达情况将细胞以106个/孔密度接种于6孔板，分为空白组、单放组、单药组及药放组，每组设3个复孔。单放组和药放组射线剂量均为4 Gy，单药组和药放组复方苦参注射液浓度取IC50值，各组作用24 h后终止反应，收集细胞，裂解离心收集上清，BCA法测蛋白浓度后上样行SDS-PAGE电泳，电泳后转膜，依次加入bcl-2和bax一抗和二抗， ECL显影并拍照，Quanti Scan软件行蛋白条带分析。

2结果

2.1细胞存活率各给药组接受不同剂量射线照射后细胞存活率均明显低于相对应的单放组(P均<0.05)，且复方苦参注射液浓度越高，细胞存活率越低;另外先放后药组的细胞存活率均较先药后放组低(P均<0.05)。见表1。

表1　各组细胞存活率比较

注：①与单放组比较，P<0.05；②与20%IC50复方苦参注射液+照射组比较，P<0.05；③与照射+20%IC50复方苦参注射液组比较，P<0.05；④与20%IC50复方苦参注射液+照射组比较，P<0.05；⑤与IC50复方苦参注射液+照射组比较，P<0.05。

2.2细胞凋亡情况DAPI染色后荧光显微镜下观察可见未经处理的空白组Hela细胞核形态规则，复方苦参注射液及放射线均可引起细胞核出现不同程度的皱缩，二者联合作用后，细胞核皱缩、碎裂现象更为明显，部分细胞坏死可见凋亡小体，药物浓度越高上述现象越明显。见图1～6。

2.3细胞周期分布情况复方苦参注射液及放射线单独和联合作用对G0/G1期及S期细胞数目影响不大，但均可使G2/M期细胞比例明显增高(P均<0.05)，细胞被阻滞在对射线敏感的G2/M期。与单独照射或单用复方苦参注射液组比较，二者联用对G2/M期的阻滞作用更加显著(P均<0.05)，且药物浓度越大效果越明显(P均<0.05)。见表2。

2.4bcl-2、bax蛋白表达情况免疫印迹及灰度扫描结果发现单放组bcl-2、bax蛋白表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；单药组和药放组bcl-2蛋白表达量均明显低于单放组(P均<0.05)，bax蛋白表达量均明显高于单放组(P均<0.05)，且药放组下调bcl-2蛋白作用优于单药组(P<0.05)。见图7。

图1　空白组细胞凋亡情况

图2　单放组细胞凋亡情况

图3　单药1组细胞凋亡情况

图4　单药2组细胞凋亡情况

图5　药放1组细胞凋亡情况

图6　药放2组细胞凋亡情况

组别G0/G1期S期G2/M期空白组69.64±0.7720.40±4.817.96±4.04单放组67.44±3.3121.90±3.8221.67±0.51①单药1组66.64±5.1515.75±6.4319.61±1.28①单药2组53.70±6.0723.80±7.6425.51±1.57①药放1组41.60±5.7916.15±7.4334.26±3.64①②药放2组43.17±9.6018.35±5.8739.56±5.75①③

注:①与空白组比较,P<0.05；②与单药1组比较,P<0.05；③与单药2组比较,P<0.05。

图7　各组bcl-2与bax蛋白表达水平

3讨论

复方苦参注射液主要含苦参碱、氧化苦参碱、脱氧苦参碱、土茯苓等多种抗癌活性成分，具有抗癌靶点多、作用效果好、毒副作用轻等优点[1]。陈芳等[3]采用MTT法观察了复方苦参注射液体外对宫颈癌细胞的放射增敏作用，但对其作用浓度、给药时序以及作用机制等并未做更深入的探讨。本实验中，笔者首先采用经典的克隆形成法证实了复方苦参注射液对宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用，且在一定的浓度范围内，复方苦参注射液的放射增敏作用可随药物浓度的升高而增强，推测其原因可能是高浓度药物可诱导更多细胞出现凋亡和死亡从而消除它们对放射线的抗拒作用。针对药物和放射线给药时序的研究结果表明，先照射后给药较先给药后照射效果好，分析原因可能是细胞受到放射线照射后,细胞线粒体外膜通透性发生改变,线粒体跨膜电位下降,向细胞基质内释放凋亡因子诱导细胞凋亡，照射后再加入复方苦参注射液可使细胞线粒体跨膜电位持续下降,线粒体功能进一步受损,加重诱导宫颈癌细胞发生凋亡[4]，也可能与复方苦参注射液能够抑制照射后宫颈癌细胞DNA损伤修复有关。

复方苦参注射液的抗癌和增敏机制与细胞凋亡和细胞周期分布等因素相关[5-6]。胡文兵等[7]发现复方苦参注射液可通过阻滞肝癌HepG2细胞周期于放射敏感的G1期来诱导细胞凋亡，并提高放射敏感性，说明细胞周期分布是影响肿瘤放射敏感性的重要因素，在细胞周期中，G2/M期对放射最敏感，G0/G1期次之，S期特别是晚S期对放射最为抗拒。bcl-2/bax的比值近年来也被认为与肿瘤放射敏感性及预后密切相关，下调bcl-2/bax的比值可增加放射敏感性,是肿瘤放疗预后的重要指标之一[8]。本研究通过DAPI染色镜下观察、流式细胞仪检测证实射线及复方苦参注射液均能够诱导宫颈癌细胞凋亡并提高G2/M期的比例，二者联用G2/M期细胞阻滞和凋亡更加显著；单药及联合照射均能上调bax蛋白表达，显著下调bcl-2蛋白表达。说明复方苦参注射液在细胞水平上可通过阻滞细胞周期于G2/M期，下调bcl-2/bax比值来诱导宫颈癌Hela细胞发生凋亡并提高其对放射线的敏感性。

[参考文献]

[1]张文谨,海丽娜,连增林. 复方苦参注射液抗肿瘤作用及其机制实验研究进展[J]. 中国中医药信息杂志,2012,19(8):101-103

[2]邓守恒,段霞,陈萍. 复方苦参注射液联合调强放疗及腔内后装治疗宫颈癌疗效观察[J]. 现代中西医结合杂志,2015,24(20):2185-2187

[3]陈芳,黄小陆,梁林. 复方苦参注射液对人宫颈癌细胞株Hela的体外放射增敏作用[J]. 广东医学,2011,32(7):842-844

[4]Beriwal S,Gan GN,Heron DE,et al. Early clinical outcome with concurrent chemotherapy and exteng-field,intensity-modulated radiotherapy for cervical cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,2007,68(1):166-172

[5]刘晓凤,简晓顺. 复方苦参注射液对人肝癌SMMC7721细胞增殖的抑制作用[J]. 中国药房,2015,26(16):2190-2192

[6]段哲萍,于新江,刘媛媛. 复方苦参注射液联合放射治疗对肺癌Lewis细胞株在体外的放射增敏作用研究[J]. 中国全科医学,2013,16(12C)：4284-4287

[7]胡文兵,高清平. 复方苦参注射液对对肝癌HepG2细胞放疗的增敏作用观察[J]. 山东医药,2010,50(45):32-34

[8]黄阗,陈茂怀,吴名耀,等. 自发性细胞凋亡及bcl2和bax基因与鼻咽癌放射敏感性关系的探讨[J]. 中国肿瘤临床与康复,2008,15(5):411

[作者简介]袁选举,男，副主任医师,研究方向为肿瘤放射治疗。 [通信作者]王贤和，E-mail:yychenping@163.com

[基金项目]湖北省教育厅项目(B20122413)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.001

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)23-2509-04

[收稿日期]2016-01-20

Radiosensitization effect of Compound Kushen Injection on cervical cancer Hela cell cultured in vitro

YUAN Xuanju，WANG Xianhe

(The People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei,China)

Abstract:Objective It is to investigate the radiosensitization effect of Compound Kushen Injection on cervical cancer Hela cell and to primarily investigate its mechanism. Methods Clone forming assay was used to observe the radiosensitizing effect; Flow cytometry method was used to detect Hela cell cycle distribution; Apoptotic changes was measured by Fluorescence microscope and DAPI staining; The expression of bcl-2 and bax protein was detected by Western blotting. Results Compared with radio alone,the cell survival rates was reduced by combination with Compound Kushen Injection(P<0.05).The cell survival rates were also depended on drug by various schedules and drug concentration(P<0.05). Compound Kushen Injection alone or combined with radiation could arrest cell cycle in G2/M phase(P<0.05),induce cell apoptosis, and the effects of combination were more significant (P<0.05). Compound Kushen Injection and radiation alone or combination all could damage the cell nucleus, the nudeus shrinkage and fragmentation was more significant in combination group (P<0.05). The levels of protein of bcl-2 was decreased and bax was increased by Compound Kushen Injection and radiation alone or combination (P<0.05). Conclusion Compound Kushen Injection has radiosensitization effect on Hela cell cultured in vitro ,which may be related to arrest in G2/M phase, induce cell apoptosis and down-regulating the ratio of bcl-2/bax.

Key words:Compound Kushen Injection; cervical cancer; radiosensitization