胆固醇代谢相关蛋白及相关特异microRNAs在胆固醇型胆囊结石患者血清中的表达及意义*

宋健，喻超，詹磊，张宏，赵小毅，张栋，孙诚谊

（贵州医科大学附属医院 肝胆外科，贵州 贵阳 550004）



论著

胆固醇代谢相关蛋白及相关特异microRNAs在胆固醇型胆囊结石患者血清中的表达及意义*

宋健，喻超，詹磊，张宏，赵小毅，张栋，孙诚谊

（贵州医科大学附属医院 肝胆外科，贵州 贵阳 550004）

摘要：目的探讨胆固醇型胆囊结石患者和健康对照人群血清中胆固醇代谢相关蛋白，以及可能靶向ABCA1的相关microR NAs（miR NAs）表达差异及意义。方法选取60例胆固醇型胆囊结石患者（结石组）和60例健康对照人群（非结石组）的血清样本，采用Western blot检测胆固醇代谢相关蛋白（SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11）的表达，利用生物信息学软件预测可能靶向调控ABCA1的相关miR NAs，采用实时荧光定量聚合酶链反应（R T-qPCR）对相关miR NAs的表达进行检测。结果结石组血清中SR EBP-2、FX R、LX R、ABCA1、ABCB11蛋白的表达量较非结石组降低（P<0.05），结石组血清中miR NA-26a、miR NA-144、miR NA-758表达较非结石组升高（P<0.05）。结论胆固醇代谢相关蛋白差异性表达及可能靶向ABCA1的相关miR NA在胆固醇型胆囊结石的发病过程中可能发挥极为重要的作用。

关键词：胆固醇型胆囊结石病；胆固醇代谢；microR NAs；生物信息学

胆囊结石是一种世界范围的常见疾病，患病人数逐年增加，各年龄段均可发病[1]。胆汁中的一种或多种成分出现失衡则有可能诱发胆囊结石的形成。以结石成分划分，37%～86%为胆固醇型胆囊结石、2%～27%为胆色素胆囊结石、4%～16%为混合型胆囊结石[2]。胆固醇型胆囊结石的成因尤为复杂，主要可归结于：胆固醇过度分泌及胆汁胆固醇过饱和、胆汁促成核及抗成核蛋白失衡、胆囊动力失调[3]，其中任何一个因素的积极干预都可能对治疗胆囊结石起重要作用。

ATP结合盒转运体（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）基因超家族中的ABCA1是体内胆固醇代谢的关键分子[4]，在胆固醇型胆囊结石形成的两个重要生物学进程中，即胆固醇代谢和胆汁成分的影响中发挥重要的调控作用[5]。microRNAs （miRNAs）是一种内生性微小（长度为18～25个核苷酸）非蛋白编码RNAs，几乎存在于所有的器官组织中，且存在稳定的表达。miRNAs通过与靶向调控mRNAs的3'-UTR端结合，在转录后水平对mRNA的表达进行调控[6]。关于miRNAs对胆囊结石成因的相关研究极少，但大量研究证明，miRNAs可通过靶向ABCA1 mRNA对体内胆固醇代谢进行调控[7]。因此，本研究利用Western blot检测及实时荧光定量聚合酶链反应（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）对胆固醇型胆囊结石患者血清中胆固醇代谢相关蛋白及可能存在靶向调控ABCA1的相关miRNAs表达情况进行分析，为胆固醇型胆囊结石临床预防和治疗提供新的实验基础和理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月-2015年6月贵州医科大学附属医院肝胆外科的60例胆固醇型胆囊结石患者血清样本（结石组）。其中，男性22例，女性38例；年龄21～77岁，平均（53.4±6.3）岁。另收集60例在本院体检中心体检的健康人员血清（非结石组）作为对照。其中，男性22例，女性38例；年龄22～75岁，平均（51.6±4.9）岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。排除病毒性肝炎、心脑血管疾病、糖尿病及代谢性疾病、近3个月内有胆囊炎急性发作及使用抗生素者。对胆囊结石采用肉眼观察结合三酰甘油检测试剂盒（glycerol phosphate oxidase peroxidase-anti-peroxidase，GPO-PAP）测定胆固醇含量的方法对胆囊结石进行分类，总胆固醇含量≥70%为胆固醇型胆囊结石，纳入实验结石组[8]。材料的选取及标本的获得均通过贵州医科大学医学研究伦理委员会，实验在伦理委员会的监督及指导下进行。

总胆固醇试剂盒（total cholesterol，T-CHO）试剂盒（南京建成生物工程研究所），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），miRcute miRNA提取分离试剂盒（北京天根生化科技有限公司），Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒（美国Thermo Scientific公司），Maxima-SYBR-Green/ROX-qPCR-Master Mix（美国Thermo Scientific公司），引物设计及合成（上海生工生物工程股份有限公司），SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11兔抗人单克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗人单克隆抗β-肌动蛋白（以下简称βactin）抗体，二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G抗体（北京中杉金桥生物技术，中国）。

1.2方法

1.2.1总胆固醇检测切取部分胆结石放入预冷的研钵中磨成粉末，每个样本精确称取10 mg，放入15 ml离心管中，加入氯仿、甲醇混合液（体积比2∶1）14ml，充分振摇1～2min后，避光常温放置20min，再充分振摇，2 min后，6 000 r/min×10 min，取上清液，按照T-CHO试剂盒说明书进行操作，采用单试剂GPO-PAP法测定胆固醇含量。

1.2.2外周血清采集检测对象禁食12 h后，于次日清晨经肘静脉穿刺采集5 ml外周全血。4℃静置2 h至血液自凝；4℃、2000×g离心5 min，上清液转移至新无RNA酶Eppendorf管中。4℃、12000×g离心15min，以彻底除去细胞碎片与杂质；将上清分装至0.2 ml Eppendorf管中，置于-80℃冰箱冷冻保存待检。

1.2.3Western blot检测蛋白表达4℃、10 000×g离心30min，提取上清液即为总蛋白。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，取40μg总蛋白上样；经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，封闭液封闭3 h，分别加入一抗：兔抗人ABCA1（1∶40000）、ABCB11（1∶1000）、SREBP-2（1∶800）、FXR（1∶400）、LXR（1∶400）和抗βactin（1∶2 000），在4℃下孵育过夜；二抗在室温下孵育2 h，增强化学发光法显色后，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像，实验重复3次取平均值。以β-actin为内参，检测两组血清的SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11平均相对表达量，以目的蛋白与内参灰度值的比值作为其蛋白表达水平。采用自动电泳凝胶成像分析软件进行图像扫描和分析。

1.2.4生物信息学预测以 PicTar、miRanda、DI ANA-microT-CDS、和TargetScanS 4个常用miRNA靶标预测软件对ABCA1进行靶基因预测并结合相关文献确立待检测的7个miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

1.2.5R T-qPCRmiRNA抽提严格按miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书进行。用miRNAs特异性引物和RevertAidTMM-MuLV逆转录酶对每个样本中的总miRNA（0.5μg）进行逆转录。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60s，共40个循环。每个反应设3个复孔，实验重复3次，取均值，miRNAs的相对表达量用2-ΔΔCt计算。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ABC A1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR在血清中的表达

本研究首先通过Western blot检测对60例胆固醇型胆囊结石患者和60例年龄、性别相匹配的健康人血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表达进行检测，结果显示，结石组患者血清中的ABCA1、ABCB11、SREBP-2、FXR、LXR蛋白表达低于非结石组（t=12.150、7.669、9.251、8.990、和10.350，P=0.000、0.001、0.000、0.000、和0.000）。见图1。

图1　Western blot检测

2.2生物信息学预测

胆固醇代谢受多种蛋白的调节，SREBP-2、FXR、LXR报道较多，目前针对ABCA1对胆固醇代谢的研究较热[9]，但其与胆固醇型胆囊结石的报道较少。故以Pic Tar、miRanda、DIANA-microT-CDS和Target Scan S 4个常用miRNA靶标预测软件对ABCA1进行靶基因预测并结合相关文献确立待检测的 7个 miRNAs：miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758。

2.3两组血清中miRNAs的表达

两组血清中的7种miRNAs（miR-10b、miR-26a、miR-33a、miR-143、miR-144、miR-145、miR-758）进行RT-qPCR反应，结果显示，结石组患者血清中的3种miRNAs（miR-26a、miR-144、miR-758）的表达水平高于非结石组（t=3.305、1.993和2.579，P=0.001、0.049和0.011），其他4种miRNAs（miR-10b、miR-33a、miR-143、miR-145）的表达水平比较，经t检验，差异无统计学意义（t=1.680、1.889、0.921和1.162，P=0.096、0.061、0.359和0.248）。见图2。

图2　两组血清miRNAs相对表达量比较

3　讨论

胆囊结石是一种常见的消化系统疾病[10]，其发病率在美国为5%～25%，在欧洲为5.9%～21.9%，在亚洲为4%～15%，在我国为3%～11%[1，11-12]。随着经济发展、饮食结构西化、人口老龄化加剧，我国胆囊结石患病率也逐年增加[13-14]。目前胆囊结石的治疗仍以腹腔镜胆囊切除术为主，胆囊切除后会出现胆汁反流、胆总管结石患病率升高、结肠癌发生率升高等不良后果[15-16]。国内外学界对于胆囊结石疾病的成因及胆囊结石发生风险因素的研究仍无定论，存在较大争议。因此，从表观遗传学思路入手，探寻胆囊结石成石机理十分重要。

本研究选取胆固醇型胆囊结石及健康人血清为研究对象，首先通过Western blot检测结石组与非结石组血清之间 SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11蛋白的表达，确实存在差异。有研究证明，FXR在小鼠肝内胆管结石模型中呈低表达状态，这可能与FXR促进胆汁酸和磷脂向胆小管的分泌，进而降低胆固醇/胆汁酸的比例，即调控胆固醇的饱和度有关[17]。LXRa与脂类代谢关系密切，可激活ABCA1和ABCG5/ABCG8的表达，增加胆固醇从肝内排出[18]。SREBP-2是胆固醇生物合成途径中的关键分子，降低其表达可导致胆汁中胆固醇过量分泌[19]。ABCA1、ABCB11是ABC基因超家族中的重要一员，是胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）的关键因素，介导细胞胆固醇外流，在胆固醇和血浆脂蛋白代谢中发挥重要作用，进而调控胆固醇输出[20]，两者在高胆固醇血症、心血管疾病、丹吉尔病、糖尿病等代谢性疾病中存在明显低表达，该低水平的表达将逆向破坏RCT过程，因此被认为是人类胆囊胆固醇结石发病可能的重要成石基因之一[21-22]。有研究认为，两者升高可导致胆固醇型胆囊结石的形成[23]，但这样的观点仍然存在争议[24-25]。笔者研究发现，两者低表达可能导致胆固醇型胆囊结石的形成。

以上提及的胆固醇代谢相关蛋白中，ABCA1作为体内胆固醇平衡的关键分子[4]，在胆固醇型胆囊结石形成过程发挥重要影响，在胆固醇代谢和胆汁酸成分的平衡中起重要的调控作用[5]。研究表明，胆固醇型胆囊结石患者胆囊黏膜中ABCA1呈高表达[26]，本研究结果与其相互印证。目前针对miRNAs 与ABCA1的研究，主要集中在miRNAs靶向调控ABCA1进而形成高胆固醇血症和高甘油三酯血症这一领域，其能极大地增加患动脉粥样硬化的风险[27]，考虑胆固醇型胆囊结石与动脉粥样硬化同为代谢综合征，有相似的致病机理[28]。因此笔者推测miRNAs同样可能靶向ABCA1，影响胆固醇型胆囊结石的形成。因此，在确定ABCA1在结石组中呈高表达后，笔者利用生物信息学技术并查阅相关文献，选取可能对胆固醇型胆囊结石存在潜在调控作用的miRNAs[20，29-31]，并通过qPCR反应检测miRNA的表达，其中miR-26a、miR-144、miR-758的表达相对升高，提示miR-26a、miR-144、miR-758极有可能通过靶向调控ABCA1影响胆固醇型胆囊结石的形成。

综上所述，本研究发现胆固醇型胆囊结石患者与非结石组血清中胆固醇代谢相关蛋白（SREBP-2、FXR、LXR、ABCA1、ABCB11）表达降低，可能存在靶向ABCA1调控的miR-26a、miR-144、miR-758表达升高，这种miRNAs特异性的表达升高可能靶向下调ABCA1，从而损害RCT过程，最终导致胆固醇型胆囊结石的形成。miR-26a、miR-144、miR-758有可能成为胆固醇型胆囊结石治疗的新靶点，为最终揭示胆固醇型胆囊结石的形成机理，提供极为重要的实验基础及理论依据。

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（童颖丹 编辑）

中图分类号：R 657.42

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.008

文章编号：1005-8982（2016）13-0043-05

收稿日期：2016-01-27

*基金项目：国家自然科学基金（No：81560477）；贵州省科技计划项目[No：黔科合SY字（2015）3047]

[通信作者]孙诚谊，E-mail：sunchengyi2014@163.com；Tel：0851-86771326

Expressions and significance of cholesterol metabolism related proteins and miRNAs targeting to ABCA1 in serum of patients with cholesterol gallstones*

Jian Song，Chao Yu，Lei Zhan，Hong Zhang，Xiao-yi Zhao，Dong Zhang，Cheng-yi Sun
（Department of Hepatobiliary Surgery，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou 550004，China）

Abstract:Objective To investigate the expressions of serum cholesterol metabolism related proteins and miRNAs maybe targeting to ABCA1 in the cholesterol gallstone patients and control subjects and the significance.Methods Serum samples from 60 patients with cholesterol gallstones（GS）and 60 without gallbladder stone（GP）were collected.The expressions of serum cholesterol metabolism related proteins（SREBP-2，FXR，LXR，ABCA1 and ABCB11）were examined by Western blot assay.The miRNAs possibly targeting to ABCA1 were predicted by bioinformatics method，the expressions of the selected miRNAs were detected by real timequantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results SREBP-2，FXR，LXR，ABCA1 and ABCB11 expressions in serum were significantly decreased in the GC patients compared to those in the healthy controls（P ＜0.05）.The serum expressions of miRNA-26a，miRNA-144 and miRNA-758 were significantly higher in the GC patients than in healthy controls（P ＜0.05）.Conclusions Abnormal expressions of cholesterol metabolism related proteins and the differential levels of microRNAs targeting to ABCA1 may play an important role in occurrence and development of cholesterol gallstones.

Keywords:cholesterol gallstone；cholesterol metabolism；microRNA；bioinformatics