Tregs及巨噬细胞在幽门螺杆菌相关的不同病变中浸润差异研究

袁小刚， 黄艳娟， 章任兵， 胡红松

深圳市龙岗区人民医院 1. 消化内科； 2. 妇产科； 3. 病理科，广东 深圳 518172

Tregs及巨噬细胞在幽门螺杆菌相关的不同病变中浸润差异研究

袁小刚1， 黄艳娟2， 章任兵3， 胡红松1

深圳市龙岗区人民医院 1. 消化内科； 2. 妇产科； 3. 病理科，广东 深圳 518172

目的 分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)阳性和阴性的慢性浅表性胃炎、胃溃疡标本中 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞 (Tregs)及巨噬细胞浸润差异，探讨Tregs及巨噬细胞在H.pylori致病中的作用。方法 168例慢性浅表性胃炎、胃溃疡标本中，H.pylori阳性89例，H.pylori阴性79例，采用免疫组化(IHC)检测病理标本中Tregs及巨噬细胞浸润情况。结果H.pylori阳性组胃黏膜标本中Tregs及巨噬细胞浸润程度显著高于H.pylori阴性组(P<0.01)；在H.pylori阳性病变组中，慢性浅表性胃炎组与胃溃疡组比较，Tregs浸润程度差异无统计学意义(P>0.05)，而巨噬细胞在胃溃疡组中浸润程度显著高于慢性浅表性胃炎组(P<0.01)；在H.pylori阴性病变患者中，Tregs及巨噬细胞浸润两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论H.pylori感染后 Tregs及巨噬细胞浸润数量均显著增加，前者抑制黏膜局部免疫反应，后者增加局部黏膜损伤，两者浸润差异及比例失衡可能是导致H.pylori感染后产生不同病变结局的原因之一。

幽门螺杆菌；调节性T细胞；巨噬细胞；免疫反应

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染后，可刺激机体募集多种炎症细胞聚集在胃黏膜层，从而产生一系列免疫反应，包括宿主固有免疫应答和获得性H.pylori特异性T细胞及B细胞相关的免疫应答，这些免疫应答可能清除体内H.pylori，同时导致黏膜不同程度的炎症及损伤。CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)可抑制病原微生物感染后机体产生的强烈免疫反应，从而减轻组织的免疫损伤，但同时也保护了病原微生物，造成病原微生物的慢性持续感染[1]。巨噬细胞具有吞噬、抗原递呈及分泌细胞因子等多种生物学功能，在促进炎症反应、清除病原微生物等多种生物学过程中扮演了重要角色。

H.pylori感染机体后，Tregs及巨噬细胞均会被募集至胃黏膜组织中，发挥免疫调节等作用[2]。然而，在H.pylori相关的不同胃黏膜病变中，这种募集是否存在差异以及Tregs和巨噬细胞浸润差异是否可能成为H.pylori感染后致胃黏膜形成不同病变的原因之一？本研究以人体胃窦黏膜标本为研究对象，采用IHC法比较H.pylori相关的不同病变中胃黏膜Tregs及巨噬细胞浸润差异，旨在探讨Tregs及巨噬细胞在人H.pylori感染中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 168例胃窦黏膜标本均取自因上消化道症状就诊的患者，通过内镜及活检病理诊断为慢性浅表性胃炎者80例，胃溃疡者88例，患者行胃镜检查时，在幽门前2 cm胃窦小弯侧活检胃窦黏膜2块置于中性甲醛中固定。H.pylori阳性组共纳入89例，其中浅表性胃炎者42例，胃溃疡者47例；H.pylori阴性组共纳入79例，其中浅表性胃炎者38例，胃溃疡者41例。试剂：浓缩型鼠抗人Foxp3单克隆抗体(ab22510，美国abcam公司)，工作浓度均为1∶300(体积比)；浓缩型鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体(ab22506，美国abcam公司)，工作浓度均为1∶500(体积比)；PV-9000第二代通用型二步法IHC染色试剂盒及浓缩型 DAB 试剂盒(614864A；3 ml)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori检测：胃窦黏膜石蜡标本行4 μm厚连续切片, 行病理常规HE染色，采用改良Giemsa 染色方法检测H.pylori。Giemsa染液配制： 2 g Giemsa染料，加入蒸馏水100 ml，过滤。染色主要步骤：(1) 石蜡切片常规脱蜡、水化；(2)蒸馏水洗3遍，滴染Giemsa染液，25 min后自来水稍洗，95%酒精分化3次，100%酒精分化2次，自然晾干、封片。患者胃镜检查前行14C呼气试验检查，以改良Giemsa染色，14C呼气试验两项检查均阳性者判断为H.pylori阳性，两项检查均阴性者判断为H.pylori阴性(见图1)。

1.2.2 Treg及巨噬细胞检测：均采用IHC二步法，主要步骤: (1) 石蜡切片常规脱蜡、水化；(2) 3%过氧化氢浸泡8 min，以阻断内源性过氧化物酶；(3) 切片置于0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中，微波炉热修复抗原15 min；(4) 分别滴加新鲜配制的鼠抗人Foxp3单克隆抗体，工作浓度均为1∶300(体积比)；鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体，工作浓度均为1∶500(体积比)；4 ℃冰箱恒温过夜；(5) 滴加聚合酶辅助剂(Polymer Helper)，37 ℃恒温培养箱内孵育30 min；(6)滴加辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37 ℃恒温孵育30 min；(7)DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。对照：淋巴结组织作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

结果判断：以细胞核染成棕黄色为阳性细胞，每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野分别计数阳性细胞及所有炎症细胞，Tregs及巨噬细胞浸润比率=阳性细胞数/总炎症细胞数，以该比率的平均值作为Tregs及巨噬细胞浸润程度。

2 结果

2.1 Tregs及巨噬细胞在H.pylori阳性与阴性病变组中的浸润情况 IHC研究结果显示H.pylori阳性组胃黏膜Tregs及巨噬细胞浸润程度显著高于H.pylori阴性组[(8.9±0.9)%vs(2.4±0.3)%、(15.3±1.2)%vs(8.2±0.7)%]，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 Tregs及巨噬细胞在H.pylori阳性患者不同病变组中的浸润情况 在H.pylori阳性病变患者中，Tregs在慢性浅表性胃炎组与胃溃疡组中的浸润程度差异无统计学意义[(9.0±0.5)%vs(8.7±0.4)%,P>0.05]，而巨噬细胞在胃溃疡组中浸润程度显著高于慢性浅表性胃炎组，差异具有统计学意义[(18.2±1.3)%vs(11.3±0.9)%,P<0.01](见图1)。

图1 Tregs及巨噬细胞在不同病变中的浸润情况及H.pyloriA：溃疡组巨噬细胞(400×)；B：慢性浅表性胃炎组巨噬细胞(400×)；C：溃疡组Tregs(400×)；D：改良Giemsa显示H.pylori(400×)

Fig 1 Tregs and macrophages infiltrated in different lesions andH.pyloriA: macrophages infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); B: macrophages infiltrated in chronic superficial gastritis lesions (400×); C: Tregs infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); D: modified Giemsa showedH.pylori(400×)

2.3 Tregs及巨噬细胞在H.pylori阴性患者不同病变组中的浸润情况 在H.pylori阴性病变患者中，Tregs及巨噬细胞浸润两组比较差异无统计学意义[(2.5±0.2)%vs(2.2±0.2)%, (8.3±0.4)%vs(8.0±0.4)%,P>0.05](见图1)。

3 讨论

全球半数以上人群感染H.pylori[3]，我国普通人群H.pylori感染率在60%左右。已证实H.pylori是慢性胃炎、消化性溃疡及胃MALT淋巴瘤的主要病因，同时也是胃癌的Ⅰ类致癌原。然而，不同地域、同一地域不同个体，或同一个体不同时间或空间，H.pylori感染的结局不尽相同，有的是慢性胃炎或消化性溃疡，有的可能直接发展为胃癌。目前多数学者[4]认为H.pylori感染后产生的不同结局是由H.pylori菌株、个体与环境3种因素相互作用所致。然而，其具体机制尚不清楚。

获得性H.pylori特异性T细胞免疫应答分为Th1型和Th2型。Th1型免疫反应释放大量细胞因子，如IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-1等作用于B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞，使其在胃黏膜局部增殖、分化、激活，产生特异性和非特异性免疫反应，过度Th1型免疫反应可造成胃黏膜组织炎性损伤，导致胃十二指肠溃疡等[5-8]。而Th2型免疫反应具有免疫调节作用，可抑制Th1型免疫应答，减轻炎症反应，促进损伤组织修复、溃疡愈合。有研究[9]显示H.pylori感染机体后，激活宿主抗原提呈细胞，募集大量中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞等炎症细胞浸润至胃黏膜层，诱导以Th1型免疫应答为主的特异性T细胞免疫反应，同时抑制Th2型免疫反应，减少B细胞分泌IgA，造成免疫系统不足以清除H.pylori，致H.pylori持续慢性感染。本研究发现H.pylori阳性的病变胃黏膜中Tregs及巨噬细胞浸润数量均显著多于H.pylori阴性者，提示H.pylori感染后，Tregs及巨噬细胞被募集至胃黏膜组织中，产生免疫应答。

巨噬细胞在不同的刺激因子作用或微环境下可极化成不同的表型，根据极化后细胞表面标志分子及其功能的不同，可将巨噬细胞分为M1和M2型。M1型巨噬细胞能高效递呈抗原、分泌大量促炎细胞因子，是激活Th1细胞反应的效应细胞，具有抗病原微生物等作用。相反，M2型巨噬细胞以发挥Th2型免疫反应为主，可抑制Th1免疫反应，具有促进损伤组织修复等功能。有研究[10]发现H.pylori感染后, 巨噬细胞分泌的细胞因子如 IL-1β、IL-6及TNF-α显著升高。这提示H.pylori感染后，胃黏膜层募集的巨噬细胞极化为M1型为主。智利一项以5～18岁未成年人为调查对象的研究[11]发现H.pylori阳性患者胃黏膜组织匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α显著高于H.pylori阴性患者，溃疡患者IL-1β和IL-8的浓度显著高于非溃疡患者。本研究发现在H.pylori阳性病变组中，巨噬细胞在胃溃疡组中浸润程度显著高于慢性浅表性胃炎组，这提示在H.pylori相关性溃疡患者中，胃黏膜内聚集的巨噬细胞以M1型为主，发生Th1型免疫应答占优势，当Th1型免疫应答得不到有效的免疫调节时，过度的Th1型免疫反应可能造成黏膜损伤，从而形成溃疡。因此，本研究结果提示胃黏膜内巨噬细胞浸润差异在H.pylori感染后形成不同结局中发挥了重要的作用。

Tregs可通过细胞接触或分泌抑制性细胞因子等方式抑制功能性T细胞，从而抑制Th1型免疫反应，增强Th2型免疫反应。研究显示H.pylori感染后胃黏膜内Tregs显著增加，Tregs 可调节H.pylori感染所产生的Th1型免疫反应，减轻组织损伤，但同时也导致H.pylori逃逸免疫清除[12-13]。本研究显示H.pylori阳性胃窦黏膜中Treg浸润显著高于H.pylori阴性者，但在H.pylori阳性组中，Tregs浸润程度在慢性浅表性胃炎组与胃溃疡组间比较差异无统计学意义。研究结果提示在H.pylori感染后，Tregs可能与巨噬细胞相互作用，调节巨噬细胞免疫应答，避免Th1型免疫反应过度造成组织损伤，使得Th1/Th2免疫反应达到一种平衡状态，黏膜损伤及修复平行进行，从而导致胃黏膜炎症持续慢性存在，这就形成了H.pylori相关性慢性胃炎；当巨噬细胞浸润密度显著增高或相对增高时，Tregs不足以调节M1型巨噬细胞所产生的Th1型免疫反应时，Th1/Th2免疫应答就失衡，Th1型免疫反应占优势，过度的Th1型免疫反应造成了胃黏膜组织炎性损伤，从而形成H.pylori相关性消化性溃疡。

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(责任编辑：李 健)

Differences of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-related lesions

YUAN Xiaogang1, HUANG Yanjuan2, ZHANG Renbing3, HU Hongsong1

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Obstetrics and Gynecology; 3. Department of Pathology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518172, China

Objective To analyze the differences of Tregs and macrophages infiltrated in the tissue specimens ofH.pylori-positive andH.pylori-negative chronic superficial gastritis and gastric ulcer,and to investigate the role of Tregs and macrophages in the pathogenesis ofH.pyloriinfection. Methods A total of 168 biopsies of chronic superficial gastritis and gastric ulcer were recruited, included 89H.pylori-positive and 79H.pylori-negative patients. Immunohistochemistry(IHC) was used to semi-quantify the number of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa.Results The proportion of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa inH.pyloripositive group was significantly higher than that inH.pylorinegative group (P<0.01). In theH.pyloripositive group, there was no significant difference of Tregs infiltration between chronic superficial gastritis and gastric ulcer group (P>0.05), but the degree of macrophage infiltrated in the gastric ulcer group was significantly higher than that in chronic superficial gastritis group(P<0.01). In theH.pylorinegative group, there was no significant difference of Tregs and macrophages infiltration between two groups(P>0.05).Conclusion The number of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-positive disease is significantly increased, the former suppresses the local mucosa immune response, while the latter increases local mucosal injury. The difference of Tregs and macrophage invasion or imbalance may be one of the causes of determining the different clinical outcomes.

Helicobacter pylori; Regulatory T cells; Macrophages; Immune response

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.012

深圳市龙岗区科技计划项目(No.YS2013011, No.YLWS20150514112402687)；深圳市科技计划项目(JCYJ20150402164314694)第一作者简介：袁小刚，硕士研究生，主治医师，研究方向：幽门螺杆菌及消化性肿瘤的基础与临床研究。E-mail:xiaogangyuan@hotmail.com

R573

A

1006-5709(2016)03-0283-04

2015-05-23