WDR1在便秘型肠易激综合征患者结肠黏膜的表达

张春燕， 孙 刚， 张修礼， 王巍峰， 杨云生， 宋志刚， 路 平

1.中国人民解放军海军总医院干部消化科，北京 100048；2.中国人民解放军总医院胃肠病及肝病中心；3.中国人民解放军总医院病理科；4.中国人民解放军海军总医院病理科

WDR1在便秘型肠易激综合征患者结肠黏膜的表达

张春燕1， 孙 刚2， 张修礼2， 王巍峰2， 杨云生2， 宋志刚3， 路 平4

1.中国人民解放军海军总医院干部消化科，北京 100048；2.中国人民解放军总医院胃肠病及肝病中心；3.中国人民解放军总医院病理科；4.中国人民解放军海军总医院病理科

目的 研究WDR1在便秘型肠易激综合征(irritable bowel syndrome with constipation, IBS-C)患者结肠黏膜的表达情况,探讨肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)发病的新机制，为未来研究提供新的思路。方法 应用Western blotting和免疫组织化学(IHC)等方法，观察WDR1在IBS-C患者结肠黏膜的表达情况。结果 WDR1在IBS-C组乙状结肠表达量明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 WDR1的表达异常提示IBS-C结肠黏膜可能存在黏膜细胞的骨架、结构完整性或细胞形态与运动的异常。结肠不同部位IBS发病的分子机制可能并不相同。

肠易激综合征；WDR1；细胞骨架

肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是临床上最常见的一种肠道功能紊乱性疾病,是一组包括腹痛、腹胀、以大便习惯改变为主要特征，并伴大便性状异常，持续存在或间歇发作，而又缺乏形态学及生物化学异常改变等可用器质性疾病解释的临床症状，大致可分为腹泻型(diarrhea-predominant IBS，IBS-D)、便秘型(constipation-predominant IBS，IBS-C)、混合型(mixed IBS， IBS-M)及未分型(unsubtyped IBS，IBS-U)。

目前IBS的发病机制尚不明确，以往研究提示肠道反应性改变(包括运动和分泌功能异常)、肠道感染及菌群失调、内脏高敏感性、N-肠轴功能紊乱、应激等可能与IBS有关,或参与IBS的发病机制。Dunlop等[1]研究了不同IBS亚型患者与正常人肠黏膜通透性的差别，发现IBS-D、IBS-C患者小肠和结肠黏膜通透性比正常人升高。结肠黏膜上皮细胞IBS通透性改变与IBS炎症及黏膜屏障功能改变有关，结肠黏膜屏障是肠道黏膜屏障的结构基础。

WDR1 蛋白，即WD40重复包含蛋白1(WD repeat-containing protein 1)，又称肌动蛋白相互影响蛋白1(actin-interacting protein 1，AIP1)，最初在听觉受损的鸡内耳中发现，是一种64 KD 的位于细胞质中的细胞骨架蛋白，在蛋白间起非常重要的作用[2]。 作为骨架蛋白，WDR1是维持细胞间紧密连接不可缺少的因子，因此，本研究应用免疫组化(IHC)、Western blotting等方法观察WDR1在IBS-C患者结肠黏膜中的表达情况，以正常健康人为对照组，以期对IBS发病机制的研究提供新的分子基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 按照罗马Ⅲ诊断标准及罗马Ⅱ科研诊断标准，选择非感染后IBS-C患者12例,男女各6例，年龄36～58岁，平均年龄(45.8±6.2)岁；健康对照组12名，男女各6名，年龄40～56岁，平均(47.8±4.5)岁。IBS-C患者及健康志愿者均获得知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准 IBS组纳入标准：符合罗马Ⅲ诊断标准及罗马Ⅱ科研诊断标准的非感染后IBS-C患者。排除标准：(1)有肠道器质性疾病及手术史者；(2)精神、神经或其他系统器质性疾病者；(3)孕妇和哺乳期妇女；(4)有消化道感染史的IBS患者，即感染后IBS (postinfectious IBS, PI-IBS )。健康对照组纳入标准：结肠息肉电切除术后复查无异常发现者(术后半年以上) 或因大便带少量鲜血行结肠镜检查诊断为痔疮者，无其他消化道症状与体征，无免疫疾病、感染病史，无近期服药史健康志愿者。

1.3 方法

1.3.1 标本钳取及处理：在进行结肠镜检查时，分别在盲肠、乙状结肠处直视下活检钳取黏膜组织(应用统一型号的活检钳)，每部位取5块，4块于冰盐水中冲洗3遍，洗去血迹，放入冻存管，立即入液氮中保存；1块立即置于10%的甲醛溶液中固定，3 d内予石蜡包埋，常规病理检查。

1.3.2 结肠黏膜HE染色：各部位标本以10%甲醛固定、石蜡包埋、4 μm厚连续切片，按常规进行。病理切片的观察由2名病理学专家完成。

1.3.3 IHC分析：石蜡切片制片：SP免疫组织化学染色，常规切片4 μm。应用兔抗人WDR1多克隆抗体(美国Abcam 公司)1∶2 000置于湿盒中4 ℃冰箱过夜或室温60 min，然后应用二抗：HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)37 ℃孵育60 min；应用苏木素复染1 min，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；光镜下观察结果。 用PBS代替一抗做对照实验，结果阴性。

1.3.4 染色结果分析：IHC染色判断标准如下：无着色为阴性，淡黄色为弱阳性，棕黄色为中等阳性，深棕黄色为强阳性。每张切片随机选5个高倍视野(200×)进行摄片，计数IHC标记定位准确的阳性细胞占所有细胞的比例并记分，其标准为胞浆或胞核阳性细胞数占所有细胞数<25%为(±)，25%～50%为(+)，50%～75%为(++)，>75%为(+++)，依次记为1、2、3、4分；染色强度弱阳性、中等阳性、强阳性依次以(±)、(+)、(++)表示，记为1、2、3分；最后计算两种记分的乘积。表达强度评分和观察结果评分的乘积为表达强度。阳性表达判定标准：表达强度综合得分>4分[3]。

1.3.5 Western blotting检测：取20 μg所提取的蛋白经过12%的分离胶分离，上样量55 μg；一抗兔抗人WDR1抗体(效价1∶1 000)， 4 ℃过夜；二抗HRP标记的羊抗兔IgG(1∶8 000)室温孵育1 h。用ECL显色试剂对膜进行显色，而后在暗室内进行显影、定影，结果分析以β-actin 蛋白表达作为参照，应用BioRad公司提供的QuantityOne分析软件进行图像分析。 测定目的显影条带和内参照GAPDH(稀释度1∶500) 的灰度值，结果以比值(样本灰度值/内参照灰度值)表示。

2 结果

2.1 WDR1在结肠黏膜的IHC表达 WDR1在正常结肠黏膜上皮细胞胞浆中呈阳性表达，显示为深棕色颗粒，上皮基底膜、固有层细胞及小血管也有表达(见图1)。WDR1在IBS-C组乙状结肠IHC染色强度分值明显高于健康对照组相应部位，差异有统计学意义(P<0.01)。WDR1在IBS-C组盲肠的IHC染色强度分值与健康对照组相应部位相比差异无统计学意义(P>0.05)；WDR1在健康对照组盲肠、乙状结肠的表达差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。阴性对照除胞核染成蓝色外，无棕黄色反应物。

2.2 WDR1在结肠黏膜中的表达 WDR1在IBS-C组乙状结肠表达量高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；WDR1在IBS-C组盲肠的表达与健康对照组的对应部位相比，差异无统计学意义(P>0.05)；WDR1在健康对照组盲肠、乙状结肠的表达差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

3 讨论

不同运动状态或不同时期的细胞常呈现不同的形态，这些形态改变都需要细胞骨架再塑形，肌动蛋白在此过程中发挥着核心作用。肌动蛋白细胞骨架在维持细胞形态和运动中起着关键作用。肌动蛋白的塑形由连接蛋白进行调控，肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白(actin deploymerization fator, ADF/cofilin)是最重要的连接蛋白之一。WDR1 蛋白的主要作用是与ADF/cofilin共同调节肌动蛋白的解聚和分离[4]，这些活动与细胞增殖、运输、迁移、趋化、胞质分裂等许多细胞生理活动有关[5]。

Oh等[6]研究发现鸟类暴露于噪声后，其耳蜗支持细胞的WDR1基因表达增强，肌动蛋白肌丝翻转加快，提示WDR1在修复细胞骨架完整性或增强细胞再生的信号转导方面发挥重要作用。Adler等[2]在研究中也发现WDR1局限在正常鸟类螺旋器的毛细胞胞浆，支持细胞中不存在，但是听觉遭受过度刺激后WDR1重新分布，在支持细胞表达上调，认为WDR1与内耳承受噪音后的应激反应有关。编码WDR1的基因位于SLC2A9下游[7]。SLC2A9及WDR1为非综合征性唇腭裂的候补基因[8]。

注：结肠上皮细胞胞浆呈阳性表达(白色箭头所示);与健康对照组相比，*P<0.01。

图1 WDR1在各组结肠黏膜IHC表达(200×) A：健康对照盲肠；B：健康对照乙状结肠；C:IBS-C盲肠；D:IBS-C乙状结肠； 图2 WDR1的染色强度分值比较

Fig 1 Immunohistochemical analysis of WDR1 expression in the colon mucosa A: caecum in healthy control group; B:sigmoid colon in healthy control group; C: cecum in IBS-C group; D: sigmoid colon in IBS-C group; Fig 2 Comparison of WDR1 staining intensity score

注：泳道1～3为健康对照组，泳道4～6为IBS-C组;与健康对照组相比,*P<0.05。

图3 WDR1在两组结肠黏膜的表达 A：盲肠WDR1的表达；B：乙状结肠WDR1 的表达；C：两组WDR1/GAPDH比较

Fig 3 Detection of WDR1 expression in colon mucosa between two groups A: WDR1 expression in caecum; B: WDR1 expression in sigmoid colon; C: comparison of WDR1/GAPDH between two groups

很多研究[9-11]证实SLC2A9与尿酸浓度及痛风有关，作为促进葡萄糖转运的蛋白基因家族成员对维持葡萄糖稳态尤为重要。基因与环境相互作用提示 SLC2A9与WDR1相互影响。研究[12]发现，IBS患者与糖代谢有关的酶表达失衡有关。WDR1表达异常，也会影响SLC2A9的表达，进一步提示IBS患者可能与代谢相关。

WDR1在结肠黏膜的表达情况还未见报道，本研究通过IHC发现WDR1蛋白在正常结肠黏膜上皮细胞胞浆表达。IBS-C结肠黏膜也呈阳性表达IHC染色强度分值可见在IBS-C组乙状结肠黏膜上皮胞浆表达量高于健康对照组，并通过Western blotting 检测进一步验证WDR1在结肠黏膜的存在，且正常结肠黏膜与IBS-C结肠黏膜存在差异改变。WDR1在IBS-C盲肠与健康对照组对应部位相比差异无统计学意义，提示IBS-C组乙状结肠可能存在影响细胞骨架及细胞生理活动的因素，使WDR1表达增高以促进细胞骨架修复或增强细胞再生。IBS-C患者仅乙状结肠黏膜WDR1出现高表达，可能提示乙状结肠黏膜分子异常对IBS-C的发病更为重要。

WDR1的研究相对较少，尤其在结肠疾病发病机制中的作用还未见报道，本研究发现WDR1在IBS-C乙状结肠表达升高，提示WDR1在功能性肠病，尤其在IBS-C的发病中可能起作用，WDR1如何参与IBS-C的发病，为何仅在乙状结肠发生异常？其升高是IBS-C发病的原因还是结果？许多的疑问需要更多的研究去解答。

WDR1表达异常可能影响细胞的骨架、结构完整性或细胞的形态与运动等。WDR1在同组不同部位表达情况有时也不一致。由此可见，结肠的不同部位可能存在不同影响IBS发病的分子机制。

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(责任编辑：李 健)

The expression of WDR1 in colonic mucosa of the irritable bowel syndrome with constipation

ZHANG Chunyan1, SUN Gang2, ZHANG Xiuli2, WANG Weifeng2, YANG Yunsheng2, SONG Zhigang3, LU Ping4

1.Department of Geriatric Gastroenterology, Chinese PLA Navy General Hospital, Beijing 100048; 2.Department of Gastroenterology and Hepatology, Chinese PLA General Hospital; 3.Department of Pathology, Chinese PLA General Hospital; 4.Department of Pathology, Chinese PLA Navy General Hospital, China

Objective To investigate the expression of WD repeat-containing protein 1 (WDR1) in colonic mucosa of the irritable bowel syndrome with constipation (IBS-C), and to provide new clues to further research on the mechisms of irritable bowel syndrome (IBS). Methods The expression of WDR1 in colonic mucosa of the IBS-C was detected by Western blotting and immunohistochemical (IHC). Results WDR1 was higher in sigmoid colon of IBS-C than that in the control group, there was statistical significance (P<0.01). Conclusion The abnormal expression of WDR1 may influence colonic cystoskeleton, cellularity, cellular morphology and cellular movement. The different parts of the colon may have different pathogenesis of IBS.

Irritable bowel syndrome; WD repeat-containing protein 1; Cystoskeleton

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.017

张春燕，博士，副主任医师，研究方向：功能性胃肠病的临床及基础研究。E-mail：xchun3@sohu.com

杨云生，博士，主任医师，研究方向：消化内镜新技术研究，功能性胃肠病临床及基础研究。E-mail：yangys@163bj.com

R574

A

1006-5709(2016)03-0299-04

2015-02-12