过坛龙提取物对急性肝损伤模型小鼠的保护作用研究

李承乐 羊 波 王小军

·论著·

过坛龙提取物对急性肝损伤模型小鼠的保护作用研究

李承乐 羊 波 王小军

目的探讨过坛龙提取物对四氯化碳（CCl4）致急性肝损伤模型小鼠的保护作用。方法腹腔注射四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型，将50只小鼠随机分为空白对照组、模型组、过坛龙低、高剂量组、联苯双酯组阳性对照，每组10只。测定小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肝组织丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，一氧化氮合酶（NOS）活性，光镜观察肝脏病理学改变。结果过坛龙低、高剂量组小鼠谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）等较模型组均有显著降低[ALT：（365.4±123.5）U/L、（275.1±21.9）U/L比（443.2±227.3）U/L，P＜0.05或P＜0.01；AST：（232.4±54.1）U/L、（195.9±11.8）U/L比（297.9±132.1）U/L，P＜0.05或P＜0.01；MDA：（0.416±0.024）nmol/mL、（0.415±0.052）nmol/mL比（0.426±0.042）nmol/mL，P＜0.05；NOS：（0.154±0.013）U/mg、（0.122±0.012）U/mg比（0.187±0.013）U/mg，P＜0.05或P＜0.01]。病理学检查显示，过坛龙提取物各剂量组较模型组肝细胞肿胀、变性、坏死程度减轻，其中高剂量组改善更显著。结论过坛龙提取物对急性肝损伤小鼠具有保护作用。

小鼠；过坛龙；四氯化碳；急性肝损伤

过坛龙，又名乌脚枪，为铁线蕨科植物扇叶铁线蕨Adiantum flabellulatum L的全草或根茎，为浙江省民间常用草药。该草性寒，味微苦涩，具有清热解毒，平肝利湿的功效[1]，民间常用于治疗急性传染性肝炎、新生儿黄疸、肺热咳嗽、小儿高热抽搐等症[2]。实验研究表明，铁线蕨总醇提物对福尔马林和巴豆油诱导的水肿有良好的抗炎活性[3]，铁线蕨甲醇提取物能清除自由基，有效抑制脂质过氧化作用和提高谷胱甘肽含量[4]。脂质过氧化（lipid peroxdation，LPO）的主要产物丙二醛（malonaldehyde，MDA）可严重损伤肝细胞的细胞结构，导致肝细胞肿胀坏死，是肝损伤的重要机制。本实验拟通过现代药理学手段开展过坛龙治疗药物性肝损伤的药效学研究，为中医药防治药物性肝损伤的研究、临床用药及进一步开发新药提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物成年健康ICR小鼠50只雌雄各半，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；实验动物生产许可证：SCXK（京）2012-0001。饲养室温度22～23℃，环境湿度50%，自由摄食及饮水。

1.2 药品和试剂过坛龙购自安徽亳州，由浙江省中医药大学陈锡林教授鉴定为过坛龙干燥全草；蒸馏水提取3次,减压浓缩,合并浓缩液为高剂量浓度12.0g/kg，蒸馏水稀释12倍得低剂量浓度1.0g/kg，4℃保存备用；CCl4：（国药集团化学试剂有限公司）；联苯双酯滴丸（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号140803）；丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号20150522），天冬氨酸氨基转移酶（AST，批号20150523），丙二醛（MDA，批号20141021）试剂盒，一氧化氮（NO，批号20150428），一氧化氮合酶（NOS，批号20150321），试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器Tissue LyserⅡ-Qiegn型匀浆机（RETSCH公司）；Sigma3K15离心机；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；SpectramaxM2型酶标仪（美国分子仪器公司）。

2 实验方法

2.1 分组及给药成年健康ICR小鼠50只，适应性喂养3天，将小鼠随机分为五组，即空白对照组、CCl4模型对照组、过坛龙提取物低、高剂量组和联苯双酯阳性对照组，每组10只。每天上午灌胃给药，连续给药7天，其中阴性对照组和模型对照组给予超纯水，阳性对照组给予联苯双酯混悬液（0.15g/kg），供试品各剂量组给予相应浓度的过坛龙提取物（低剂量1.0g/kg、高剂量12.0g/kg）。药物给足9天后，除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.4% CCl4（10mL/kg）进行造模。造模16h后，称重取血，解剖小鼠，取肝脏称重，计算脏器系数，左叶固定，右叶冻存。

2.2 检测指标及方法

2.2.1 血清生化指标检测将小鼠血于室温静置20～60min后离心取血清，检测血清天门冬氨酸氨基转换酶（AST）和丙氨酸氨基转换酶（ALT）。

2.2.2 肝脏病理学检测及肝脏系数测定将肝脏用4℃生理盐水洗净，滤纸擦干，肝脏称重后并按肝脏重量：100g体质量进行肝脏系数的计算。肉眼观察肝脏外形形态，取右小叶，10%甲醛固定，常规HE染色，光镜下进行病理学观察。

2.2.3 肝匀浆生化指标检测将冻存的肝组织，在4℃生理盐水中漂洗，滤纸拭干，准确称取0.1g，加0.9mL生理盐水制成10%肝组织匀浆，离心，取上清液，按试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明测定一氧化氮合酶（NOS）活性，丙二醛（MDA）和一氧化碳（NO）的含量。

2.3 统计学方法数据以均数±标准差（x±s） 表示，应用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，LSD进行组间的两两比较，P＜0.05示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 五组小鼠肝脏形态学变化正常组小鼠肝脏形态正常，外观红褐色，分页清楚，被膜光滑无出血点，质地柔软并有弹性。模型对照组小鼠肝脏体积略有肿大，小叶受损严重，质地偏硬，颜色晦暗，表面有弥散性出血点并有花斑样病变，各给药组小鼠肝脏受损程度轻于模型对照组。与空白对照组相比，模型对照组的肝脏系数偏大，差异有统计学意义（P＜0.01）。过坛龙各组小鼠肝脏系数略大于空白对照组，但明显小于模型对照组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组小鼠肝脏系数比较（g，x±s）

3.2 五组小鼠肝组织病理切片显微镜观察空白对照组（插页图1-A）小鼠肝组织以中央静脉为中心向四周放射状排列，肝细胞形态及结构正常，排列整齐，大小均匀，细胞核大而圆，无细胞肿胀及坏死；模型对照组（插页图1-B）中央静脉和汇管区周围肝细胞大量变性坏死，较大范围的肝细胞肿胀和细胞脂肪变性，并有炎性细胞浸润；阳性对照组（插页图1-E）中央静脉周围灶状肝细胞肿胀，脂肪变性减轻肝细胞水肿减轻，坏死灶减少；过坛龙低（插页图1-C）、高（插页图1-D）剂量组与模型组比较，肝细胞坏死数量减少，以细胞肿胀和细胞脂肪变性为主，炎性细胞浸润程度也显著减轻。高剂量组与低剂量组相比，效果更显著。

3.3 五组小鼠血清生化指标比较与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清ALT、AST显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，联苯双酯组小鼠血清中ALT和AST活性明显降低（P＜0.01）。过坛龙低、高剂量组小鼠血清ALT和AST活性也降低（P＜0.05，P＜0.01），其中，高剂量组小鼠AST低于联苯双酯组（P＜0.05）。见表2。

表2 血清生化指标（U/L，x±s）

3.4 五组小鼠肝组织匀浆生化指标比较模型对照组小鼠肝组织匀浆MDA、NO、NOS均高于空白对照组（P＜0.05或P＜0.01），与模型对照组比较，过坛龙提取物低、高剂量组、联苯双酯组MDA、NO、NOS明显降低（P＜0.05或P＜0.01），其中过坛龙提取物高剂量组NOS明显低于联苯双脂组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肝匀浆MDA、NO、NOS含量比较（x±s）

4 讨论

肝细胞在肝损伤时通透性增加，ALT和AST被释放入血，故ALT和AST水平高低可以反应肝细胞的损伤程度和药物治疗肝损伤的效果[5-6]。MDA是脂质过氧化的最终产物，可影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性并引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合最终导致细胞肿胀坏死。因此，MDA含量可以反应脂质过氧化程度，间接反应细胞损伤程度[7-8]。经CCl4处理后，模型组小鼠血清ALT和AST，肝匀浆MDA含量明显升高，肝脏指数也显著增大，肝匀浆MDA含量也升高，表明模型建立成功。过坛龙提取物低、高剂量组与模型组相比，ALT和AST显著下降，MDA显著下降并呈现一定的量效关系，提示过坛龙提取物可能通过提高抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂质过氧化反，减少MDA的产生，起到对肝脏的保护作用。

NO是脂溶性气体物质，体内的NO由一氧化氮合成酶（NOS）以L-精氨酸为底物合成，NO在肝脏疾病中的作用受到广泛关注。研究显示，肝损伤模型中，NOS合成增加，释放大量NO。NO可与过氧化物结合生成过氧亚硝酸盐化合物，是氧化损伤的重要自由基之一，也是组织损伤的诱发因子和各种病变的增强因子[9]。与空白对照组相比，CCl4模型组小鼠肝匀浆NO水平升高，NOS表达增强。与模型组比较，过坛龙低高剂量组NO含量有所降低，NOS表达明显减弱（P＜0.05），提示在CCl4所致肝损伤模型中，NOS活性增强，产生大量具有细胞毒性的内源性NO，过坛龙实验组可以通过抑制NOS活性，降低NO的产生而达到对肝脏的保护作用。

综上所述，过坛龙提取物可明显降低CCl4所致肝损伤模型小鼠血清ALT和AST活性，减少丙二醛（MDA）和NO含量，降低NOS活性。

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（收稿：2016-06-29修回：2016-08-05）

Protective Effect of the Extract from Flabelate M aidenhair Herb on Acute Hepatic Injury in M ice

LI Chengle,YANG Bo,WANG Xiaojun.Tongde Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the protective effects of flabelate maidenhair herb extract against acute liver injury induced by carbon tetrachloride（CCl4）in mice.M ethods The mouse model of acute liver injury was induced by intraperitoneal injection of CCl4.Fifty ICR mice were random ly divided into 5 groups（n=10）：normal control group,model group,bifendate pills group,and high-dose and low-dose flabelate maidenhair herb extract groups.Serum alanine aminotransferace（ATL）and aspartate aminotransferase（AST）were determined;malonaldehyde（MDA）,nitricoxide（NO）content and nitricoxide synthase（NOS）activity in liver tissue were measured.Pathological changes of liver tissue were observed under light microscope.Results ALT,AST,MDA,NO,and NOS in lowdose and high-dose flabelate maidenhair herb groups were lower than those in model group（ALT：365.4±123.5U/L and 275.1±21.9U/L vs 443.2±227.3U/L,P＜0.05 or P＜0.01;AST：232.4±54.1U/L and 195.9±11.8U/L vs 297.9±132.1 U/L,P＜0.05 or P＜0.01;MDA：0.416±0.024 nmol/mL and 0.415±0.052 nmol/mL vs 0.426±0.042nmol/mL,P＜0.05NOS：0.154±0.013U/mg and 0.122±0.012U/mg vs 0.187±0.013U/mg,P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological examination results showed milder liver cellular swelling,degeneration and necrosis in both flabelate maidenhair herb extract groups compared with those in model group;the pathological injury had been more obviously decreased in high-dose group.Conclusion The extract from flabelate maidenhair herb has a protective effect on acute liver injury induced by CCl4 in mice.

mice;flabelate maidenhair herb;carbon tetrachloride;acute hepatic injury

浙江省中西医结合学会科研项目（No.2014LYZD011）

浙江省立同德医院药剂科（杭州310012）

李承乐，Tel：（0571）89972234；E-mail：464992768@qq.com