液相色谱-质谱法快速检测4 种乳源低聚糖

魏京华，陈历俊，赵军英，张 毅，景萌娜，王 品，姜铁民，*，乔为仓（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116000；.北京三元食品股份有限公司国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京 100163）



液相色谱-质谱法快速检测4 种乳源低聚糖

魏京华1，2，陈历俊1，2，赵军英2，张 毅2，景萌娜1，2，王 品1，2，姜铁民2，*，乔为仓2
（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116000；2.北京三元食品股份有限公司国家母婴乳品健康工程技术研究中心，北京 100163）

建立一种乳样经简单预处理后采用超高效液相色谱-串联质谱同时检测4 种重要的乳源低聚糖方法。牛乳及人乳经过脱脂、脱蛋白后经amide液相色谱柱用0.1%氨水-乙腈溶液梯度分离，采用质谱检测。2 种唾液酸乳糖标准品的标准曲线在0.78～50.00 mg/L范围内线性良好（R2＞0.990），2 种岩藻糖乳糖标准品的标准曲线在1.56～100.00 mg/L范围内线性良好（R2＞0.990）。加标回收率在80.00%～100.00%之间，重复性、精密度实验所得相对标准偏差均小于5.00%。

超高效液相色谱-串联质谱；低聚糖；牛乳；人乳

牛乳是一个复杂的混合物，它是由脂质、低聚糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质和其他生物活性物质组成［1］。而低聚糖作为人乳中除蛋白、脂类之外的第三大丰富的物质，含量在7～12 g/L。不同低聚糖在含量、结构和分子质量方面存在很大差异［2］，它们是由2～10 个单糖残基通过糖苷键共价连接形成［3］，不仅包括多种高度支化的种类，还有同一分子质量不同结构排列，有100 种以上结构［4-5］，是一种极其复杂的混合物。乳源低聚糖是儿童生长发育的主要营养物质之一，对青少年智力发育也十分重要［6］。此外，有报道［7］表明双歧杆菌可以在以纯化的人乳低聚糖作为唯一碳源的环境中生长，这也证实了人乳低聚糖可以刺激有益双歧杆菌在婴儿肠道内增长这一假说。低聚糖也可以通过抑制病原体在小肠黏膜表面的附着力来防止感染［8］。特别的是，人乳因其中岩藻糖乳糖和唾液酸乳糖含量高，被认为是独一无二的［9］。作为牛乳、人乳中含量都相对高的唾液酸乳糖，对婴幼儿大脑发育至关重要［10］。

低聚糖有着如此重要的作用，研究其生物学功能的必要前提是对大批量的乳样中低聚糖进行定量分析［11］。然而，乳源低聚糖结构复杂同分异构种类多，同时检测出所有低聚糖有一定难度。因此，本实验选择对婴幼儿生长发育具有重要生物学功能的乳源低聚糖为代表，检测其含量。

目前常用的低聚糖分离和结构鉴定方法有：离子色谱、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用、毛细管色谱。方法比较见表1。

表1 几种低聚糖检测方法比较Table1 Comparis on s of several methods used for oligosaccharide detecti on

比较近年来低聚糖检测的各种方法，不难看出低聚糖的检测一般分为2 个过程，一是液相分离；二是分离后经检测器检测。而目前应用广泛的是液相色谱的一些比较常用的检测器以及质谱。但是与常用检测器相比较，质谱作为检测器时可以根据其提供的相对分子质量和子离子信息以及子离子所对应的质谱图，更快更准确地定性与定量，很好地解决了同分异构体由于分子质量相同结构相似而在液相中不能完全分离无法定性定量这一难题。

据目前报道［26］来看，乳样前处理一般采用还原法，即乳样离心脱除脂和蛋白后用NaBH4还原，经石墨碳柱洗脱后真空干燥，最后用去离子水溶解经液相色谱-质谱联用检测。这种处理方法复杂，洗脱过程费时，对样品损耗多，且目前报道鲜见同时检测人乳和牛乳的方法。本实验旨在开发一种经简单处理后可快速准确并可同时检测乳源低聚糖的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳、人乳 北京三元食品股份有限公司；3-岩藻糖乳糖（3-fucosyllactose，3-FL） 法国Elicityl-OligoTech公司；2′-岩藻糖乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、6′-唾液酸乳糖（6′-sialyllactose，6′-SL）英国Dextra Laboratories公司；3′-唾液酸乳糖（3′-sialyllactose，3′-SL） 美国Sigma公司；无水乙醇（分析纯） 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

超低温冰箱 美国Thermo公司；D-37520微量高速离心机 美国Thermo Scientific Sorvall公司；Milli-Q A10超纯水净化器 美国Millipore公司；3K-15高速冷冻离心机 美国Sigma公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；0.22 µm滤膜 美国Agela公司；ACQUITY超高效液相色谱仪、TQD电喷雾串联四极杆质谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：所购4 种标准品均为1 mg，将其溶解在1 mL水中，摇匀备用，即得含量为1 mg/mL的标准品储备液。

取3′-SL、6′-SL各50 µL，2′-FL、3-FL各100 µL，混合后加水至1 mL，混匀，此时3′-SL、6′-SL质量浓度为50 mg/L，2′-FL、3-FL质量浓度为100 mg/L。取此混合液逐级稀释配制不同质量浓度的标准溶液，见表2。

表2 标准品溶液质量浓度Table 2 C on centrati on s of st and ardsoluti on s

1.3.2 样品前处理

目前牛乳和人乳中脱除蛋白质的方法主要有2 种，乙醇沉淀法［27］和乙腈沉淀法［11］，为建立一种提取乳源低聚糖的快速方法，本实验对2 种方法进行对比，具体如下。

乳样在4 000×g、4 ℃条件下离心15 min脱除上层脂，下层清液添加2 倍体积分数66.7%乙醇溶液，混匀后在-80 ℃放置30 min，取出经13 000 r/min离心30 min脱除下层蛋白质取上层清液加水稀释，待检测。

乳样添加3 倍体积乙腈（1∶1，V/V）溶液，手摇振荡后采用超声均质2 min，然后在室温条件下8 000 r/min离心15 min，取清液加水稀释，待检测。

1.3.3 超高效液相色谱条件

A C Q U I T Y U P L C B E H a m i d e液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；柱温30 ℃；流动相A为乙腈，B为0.1%氨水；流速150 µL/min；在实验室所建立的分离方法基础上，优化得到流动相梯度洗脱条件，流动相梯度洗脱程序，见表3。

表3 流动相梯度洗脱程 序Table 3 Gradients of mobilephasesA and B

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源（负离子模式）；负离子扫描；多反应监测；毛细管电压3.8 kV；锥孔电压21 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气（N2）流量700 L/h；锥孔反吹气流量30 L/h；碰撞气（Ar）流量0.14 mL/min。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

2 种前处理方法处理同一种乳样，采用相同的超高效液相色谱-串联质谱条件检测，检测结果见表4。

表4 2 种前处理方法条件下检测含量比较Table 4 Comparis on of twosamplepretreatment methods used for oligo sac ch aride deter m in a ti on

由于2′-FL和3-FL在牛乳中含量极少，且响应值很低，故检测不到。由表4可看出，无论是牛乳还是人乳，经第2种方法处理后含量减少，人乳中3′-SL、 6′-SL、2′-FL、3-FL含量分别减少8.13%、9.52%、12.58%、1.09%，而牛乳中3′-SL、6′-SL含量分别减少19.95%、2.25%。推测原因，可能是乙腈对蛋白的沉淀率比较高，沉淀蛋白多，使低聚糖夹杂在蛋白里一起沉淀，但鲜见文献报道证明，具体原因还需要进一步确定。因此由表中比较得出，本实验采取乙醇沉淀蛋白的方法，即选用第1种前处理方法。

2.2 质谱条件的确定

在负离子模式下，对低聚糖的标准品进行离子全扫描，以确定4 种糖的准分子离子并优化质谱条件。以其准分子离子为其母离子，对其子离子进行全扫描，选择丰度较高的2 个离子分别作为定性和定量离子（响应值高的子离子为定量离子，另外一个为定性离子）；其分子结构见表5。在负离子和多反应监测模式下优化各种质谱调谐参数，以提高检测灵敏度，如图1所示。

表5 4 种低聚糖结构Table 5 Structures of 4o ligosaccharides

图1 4 种糖的总离子扫描图Fig.1 Full scan mass spectra of4 oligosaccharides

图1中从各种低聚糖图谱中选取的子离子信息如表6所示。目前文献中报道的是还原后的母离子及相应子离子［20］，因还原后分子质量增加，因此在相同的质谱条件下，所产生的子离子信息不同。本实验给出未还原低聚糖的母离子及子离子信息，为低聚糖检测方法的建立提供重要的参数依据。

表6 质谱检测参数Table 6 Mass spectral parameters

2.3 色谱条件的选择

因本实验所选择为2 组同分异构体，尤其是SL的2 个同分异构体，由表6可知，两者选取的子离子信息相同，因此必须优化超高效液相色谱梯度洗脱条件将两者分离，才能达到同时检测的目的。在已得到的最优色谱条件下，4 种低聚糖标准品经超高效液相色谱分离，如图2所示。

图2 标准品及样品的液相色谱图Fig.2 Chromatograms of mixed standard solutions and2 samples

如图2所示，在本实验优化的超高效液相梯度洗脱条件下，4 种代表性低聚糖得到较好的分离，可进一步采用质谱检测。现有文献报道中，梯度洗脱时间多为40 min以上［20，27］，而本实验所建立梯度洗脱时间仅有20 min，有效提高了检测速度，更适用于大批量样品的检测。

对不同质量浓度的标准溶液进行色谱分析，以质量浓度为X轴、峰面积为Y轴做图，建立标准曲线，如表7所示。

表7 回归方程及定量检出限Table 7 Regressi on equati on s and limits of detecti on

由于糖的检测响应值比较低，质量浓度过低检测不准确，根据Totten等［27］所做其他低聚糖和Hong等［20］所做的2′-FL、3′-SL、6′-SL的检测范围，将本实验中4 种糖的检测范围定在0.78～100.00 µg/mL之间，而同等质量浓度的SL明显比FL响应值高，为了更直观地观察4 种糖的色谱分离情况，故将FL的质量浓度定为SL的2 倍。在此质量浓度范围内回归方程R2都在0.990以上，由此确定本实验中4 种低聚糖在设定的质量浓度范围内线性良好。

2.4 回收率及精密度结果

由于牛乳、人乳选取相同的前处理方法，且2 种乳中低聚糖种类相似，只是在种类数量及每种含量上有所差别，所以对前处理方法回收率和精密度的方法检测选取了2 种乳中共同有的且含量相对少的一种低聚糖3′-SL做检测。取人乳、牛乳500 µL，分别添加3′-SL标准品50.00、25.00 µg，经前处理后进样检测，如表5所示。

对于仪器的精密度采用同一样品重复进针5 次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于5.00%之间，处理方法的准确性采用平行处理5 个样检测，得到的RSD也小于5.00%，精密度较高，说明本实验所应用的实验方法和检测仪器足够适用于这4 种低聚糖的检测分析。

表8 回收率检测Table 8 Recoveries of spiked milks amples

2.5 方法比较

将本实验所用方法与其他文献对比，见表9。

表9 不同方法检测结果比较Table9 Comparis on of analyticalr esults for the determ in ati on of milk oligo sac ch aride sby differe nt me tho ds

3 结 论

本实验所建立的检测方法与之前所报道的方法比较样品前处理简单、用量少且不需要繁琐的还原、固相萃取等过程，排除了其他试剂可能造成的干扰，回收率和重复性好，且可同时检测牛乳和人乳，完全适合4 种乳源低聚糖的检测。本实验对于牛乳和人乳中低聚糖的测定以及以后深入探讨更多低聚糖的测定方法提供参考。

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Rapid and Simultaneous Detection of 4 Milk Oligosaccharides Using LC-MS

WEI Jinghua1，2， CHEN Lijun1，2， ZHAO Junying2， ZHANG Yi2， JING Mengna1，2， WANG Pin1，2， JIANG Tiemin2，*， QIAO Weicang2
（1.School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Liaoning 116000， China；2.National Maternal and Infant Health Dairy Researching Center of Beijing Sanyuan Foods Co.Ltd.， Beijing 100163， China）

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was used to rapidly and simultaneously detect 4 oligosaccharides in bovine milk and human milk.Samples were defatted， deproteined，resolved on an ACQUITY BEH amide column using gradient elution with 0.1% ammonia water/acetonitrile as mobile phase， detected by mass spectrometric specific ion monitoring and quantified.The standard curves of 2 fucosyllactose oligosaccharides were linear within the range from 0.78 to 50.00 mg/L with R2＞ 0.990.The standard curves of 2 sialyllactose were linear within the range from 1.56 to 100.00 mg/L with R2＞ 0.990.The recoveries of spiked samples ranged from 80.00% to 100.00%.The relative standard deviation （RSD） of repeatability and precision was less than 5.00%.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； oligosaccharides； bovine milk； human milk

10.7506/spkx1002-6630-201614015

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0086-06

魏京华， 陈历俊， 赵军英， 等.液相色谱-质谱法快速检测4 种乳源低聚糖［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 86-91.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614015. http://www.spkx.net.cn

WEI Jinghua， CHEN Lijun， ZHAO Junying， et al.Rapid and simultaneous detection of 4 milk oligosaccharides using LC-MS［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 86-91.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614015. http:// www.spkx.net.cn

2015-12-09

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B04）；北京市科技计划项目（D141100004814002）

魏京华（1989—），女，硕士，研究方向为发酵乳制品。E-mail：weijinghua1989@163.com

*通信作者：姜铁民（1971—），女，教授级高级工程师，硕士，研究方向为乳品加工。E-mail：jiang515910@126.com