响应面试验优化果胶酶辅助提取锁阳原花青素工艺

崔 玮，张 勇，2，高海宁，2，焦 杨，李彩霞，2，*（.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000）



响应面试验优化果胶酶辅助提取锁阳原花青素工艺

崔 玮1，张 勇1，2，高海宁1，2，焦 杨1，李彩霞1，2，*
（1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000）

利用单因素试验和响应面法优化果胶酶辅助乙醇提取锁阳原花青素工艺。通过单因素试验筛选出酶解时间、pH值、酶解温度、乙醇体积分数作为影响因素，以锁阳原花青素提取得率为响应值进行Box-Behnken试验设计，建立锁阳原花青素提取得率的二次回归方程，得到最优提取条件。响应面法分析结果表明锁阳原花青素的最佳提取工艺参数为：在果胶酶质量分数为1%时，酶解时间34 min、pH 4.8、酶解温度52 ℃、用体积分数70%乙醇溶液浸提1.5 h。该条件下，锁阳原花青素提取率达14.30%。

锁阳；果胶酶；原花青素；响应面法

锁阳（Cynomorium songaricum Rupr.）为锁阳科锁阳属多年生肉质寄生草本植物，分布于我国西北沙漠地带，主要产地在内蒙古、甘肃、宁夏等［1］。锁阳又名地毛球、锁严子、锈铁棒等，具有补肾壮阳、润肠通便、益精补血等功能［2］。锁阳含有单宁、固醇类、三萜、黄酮、生物碱、没食子酸、原花青素等多种生物活性成分［3］。

原花青素是一类多酚类化合物，植物中广泛存在，具有清除自由基、抗氧化，抗突变、抗癌、抗辐射、预防血栓形成，广泛应用于食品、医药、保健品等领域［4-7］。原花青素的提取方法主要有溶剂萃取法［8］、超声辅助提取法［9-10］、酶法提取法［11］等。

生物酶法（主要是纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等及其复合酶类）是利用酶对植物细胞壁进行降解和破坏，使有效成分充分暴露出来，从而提高有效成分的提取率的技术，该技术是一种新型、高效的绿色提取技术，反应条件温和、杂质易除、节约能耗、高效、减少热敏成分的降解，广泛地应用于药品、食品及动植物细胞有效成分的提取［12-15］。禹华娟等［16］用纤维素酶和果胶酶对莲房原花青素酶解提取，与乙醇提取相比原花青素提高48%；汪志慧等［11］研究双酶法提取莲房原花青素，提取率比单一乙醇提取显著提高；薛昆鹏等［17］研究超声微波酶解协同提取油茶壳中原花青素，其结果均高于微波、超声及超声-微波协同提取。

响应面分析法是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，能以用较少的试验数量和时间对试验进行全面研究，对因素及其交互作用的影响也可以进行评价，可以有效快速地确定多因素系统的最佳条件［18］。响应面法虽然广泛用于众多过程优化控制等领域［19-21］，但关于锁阳原花青素果胶酶法提取工艺条件的优化鲜见报道。本研究以锁阳为材料，运用响应面法优化酶法提取锁阳中原花青素的工艺，以期为锁阳的资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

锁阳2011年4月采于张掖红沙窝，由河西学院农业与生物技术学院张勇教授鉴定为锁阳科植物锁阳的肉质茎。

果胶酶制剂（多聚半乳糖醛酸酶82%、果胶酯酶16%、果胶裂解酶2%） 上海杰兔工贸有限公司；（+）-儿茶素 上海友思生物技术有限公司；香草醛、甲醇、浓盐酸、乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DKB-501数显超级恒温水浴锅 扬州市三发电子有限公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；pH510酸度计 安莱立斯仪器科技（上海）有限公司；SHZ-2000循环水式真空泵 河南省巩义市英峪予华仪器厂；MiLLROCK冷冻干燥机 美国Commillrock公司；BT125D电子天平 德国Sarstorius公司。

1.3 方法

1.3.1 锁阳原花青素提取工艺流程

新鲜锁阳→清洗泥土→切片→冷冻干燥→粉碎过60 目筛→准确称取锁阳粉1 g→根据预设条件添加果胶酶处理→调整乙醇体积分数为70%浸提一定时间→减压过滤→上清液定容50 mL→锁阳原花青素提取液

1.3.2 锁阳原花青素提取率测定

1.3.2.1 儿茶素标准曲线的绘制

采用香草醛-盐酸法［22-23］测定锁阳提取物中原花青素的含量。将儿茶素标准品溶解于甲醇中，配制成0.2 mg/mL的儿茶素标准溶液，分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于试管中，用甲醇补充至0.5 mL，依次加入3.0 mL质量浓度4.0 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液、1.5 mL浓盐酸，加塞摇匀，在避光条件下反应15 min后，于500 nm波长处测其吸光度。以儿茶素含量（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制儿茶素标准曲线，得到回归方程：Y=5.662 9X+0.011 5，相关系数R2=0.998 3。

1.3.2.2 原花青素提取率的计算

将锁阳原花青素提取液稀释20 倍，准确吸取0.5 mL 按1.3.2.1节的方法操作，于500 nm波长处测定其吸光度，重复3 次，取平均值。按以下公式计算原花青素提取率。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 果胶酶质量分数对锁阳原花青素提取率的影响

准确称取1 g锁阳粉末5 份，分别加入质量分数为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的果胶酶10.0 mL （pH值为5的柠檬酸-磷酸缓冲液配制），在50 ℃保温30 min，冷却，加入无水乙醇，使其体积分数为70%，在50 ℃恒温浸提1 h，减压过滤，计算原花青素提取率，从中选择果胶酶最适质量分数。

1.3.3.2 酶解时间对锁阳原花青素提取的影响

准确称取1 g锁阳粉末5 份，分别加入pH 5质量分数为1%（根据1.3.3.1节的结果取值）果胶酶10 mL，在50 ℃保温20、30、40、50、60 min，其余条件同1.3.3.1节，计算提取率。考察酶解时间对锁阳原花青素提取的影响。

1.3.3.3 pH值对锁阳原花青素提取率的影响

准确称取1 g锁阳粉末6 份，分别加入pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的质量分数1%果胶酶10.0 mL，在50℃保温30 min（根据1.3.3.2节的结果取值），其余条件同1.3.3.1节，计算提取率。考察pH值对原花青素提取的影响。

1.3.3.4 酶解温度对锁阳原花青素提取率的影响

准确称取1 g锁阳粉末5 份，均加入pH 5（根据1.3.3.3节的结果取值）、质量分数为1%果胶酶10 mL，分别置于温度为30、40、50、60、70 ℃水浴中保温30 min，其余条件同1.3.3.1节，计算提取率。从中选择最适酶解温度。

1.3.3.5 乙醇体积分数对锁阳原花青素提取率的影响

准确称取1 g锁阳粉末5 份，均加入pH 5质量分数为1%果胶酶10 mL，置于50 ℃（根据1.3.3.4节结果取值）保温30 min，冷却，加入无水乙醇使其体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%，在50 ℃恒温浸提1 h，减压过滤，计算提取率。考察乙醇体积分数对原花青素提取的影响。

1.3.3.6 浸提时间对锁阳原花青素提取率的影响

准确称取1 g锁阳粉末5 份，加入pH 5质量分数为1%果胶酶10 mL，置于50 ℃保温30 min，冷却，加入无水乙醇使其体积分数为70%（根据1.3.3.5节结果取值），在50 ℃恒温浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，减压过滤，计算提取率。

1.3.4 响应面试验

响应面法试验设计［18］采用Box-Behnken模型，以酶解时间、pH值、酶解温度以及乙醇体积分数为考察因素，分别用X1、X2、X3、X4表示，并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，因素编码及各自变量水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table1 Factors and l evels used for Box-Behnken design

1.4 数据统计

采用Excel 2003和Design-Expert 8.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 果胶酶质量分数对锁阳原花青素提取效果的影响

图1 果胶酶质量分数对原花青素提取率的影响Fig.1 Effect of pectinase dosage on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由图1可知，随着果胶酶质量分数的增加，原花青素提取率不断上升，当果胶酶质量分数高于1%时，继续增加质量分数，原花青素提取率反而有下降，主要原因是在低质量分数条件下，底物和酶可较充分地结合，使细胞壁和细胞间的果胶物质充分水解，进而使有效成分溶出。继续增加果胶酶质量分数，底物质量浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制，从而使原花青素的提取率降低。因此，果胶酶质量分数为1%时，原花青素提取效果最好。

2.1.2 酶解时间对锁阳原花青素提取效果的影响

图2 酶解时间对原花青素提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由图2可知，随着酶解时间的延长，原花青素的提取率不断增大，当酶解时间达到30 min时，原花青素提取率达到最大，说明酶解反应基本进行彻底；继续延长酶解时间，提取率反而有下降。其原因原花青素是酚类成分，随着酶解时间继续延长，原花青素的稳定性降低使得氧化程度增高，导致提取率降低，因此，从节能省时方面综合分析，酶解时间应以30 min为宜。

2.1.3 pH值对锁阳原花青素提取效果的影响

图3 pH值对原花青素提取率的影响Fig.3 Effect of pH values on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由图3可知，当pH值在3～5范围内，随pH值的升高，原花青素提取率逐渐增大；当pH值大于5.0时，随pH值的升高，原花青素提取率逐渐降低。说明该酶的最适pH值为5左右，在此条件下，锁阳的细胞壁降解和破坏程度最大，从而使更多的有效成分释放到溶剂中，因此酶解液pH值应选择4～6范围。

2.1.4 酶解温度对锁阳原花青素提取效果的影响

图4 酶解温度对原花青素提取率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of proanthocyanidins

如图4所示，当温度低于50 ℃时，随着温度的升高，原花青素的提取率不断增加；当温度高于50 ℃时，随温度的升高，原花青素的提取率呈现下降的趋势。这主要是由于温度对酶促反应的双重影响：在未达到酶的最适温度前，升高温度增加酶和底物分子在内的溶液体系的热能既可使细胞内活性物质分子运动速率加快，又能提供酶促反应所需的能量，使酶解反应加强，因此原花青素提取率不断增加；然而温度继续升高会导致维系酶空间结构的非共价键断裂，从而使生物酶变性，酶促反应受到抑制，得率降低［21］。另外温度影响原花青素的稳定性，所以酶解温度应选择50 ℃为宜。

2.1.5 乙醇体积分数对锁阳原花青素提取效果的影响

图5 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of proanthocyanidins

如图5所示，随着乙醇体积分数的增加，原花青素提取率增大，当达到70%时，原花青素提取率最高，而后，乙醇体积分数再增加，原花青素提取率降低，这是因为一些醇溶性杂质溶出量增加，它们与原花青素竞争和乙醇-水分子结合，从而导致原花青素提取率降低。

2.1.6 浸提时间对锁阳原花青素提取效果的影响

由图6可知，随着浸提时间的延长，原花青素的提取率略有增加，当浸提时间为1.5 h时，提取率达到最大，继续延长时间，原花青素提取率又有所降低，这可能是因为随着浸提时间的延长，原花青素氧化从而使提取率降低。由图6可以看出，乙醇浸提时间影响不大，因此优化浸提时间为1.5 h。

图6 浸提时间对原花青素的提取率的影响Fig.6 Effect of extraction time on the extraction efficiency of proanthocyanidins

2.2 响应面法试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果分析

因为浸提时间和酶质量分数对锁阳原花青素提取率的影响不显著，所以在进行响应面设计时，固定酶质量分数1%、浸提时间1.5 h；以影响提取效果较大的因素酶解时间（X1）、pH值（X2）、酶解温度（X3）以及乙醇体积分数（X4）作为自变量，以锁阳原花青素提取率为响应值（Y），共29个试验点，其中24 个为析因点，5 个为中心点，中心点重复的目的是估计整个试验的纯试验误差。锁阳原花青素提取的响应面试验设计方案与结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experiment design and result for resp on se surface analysis

2.2.2 模型的建立与显著性分析

利用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到锁阳原花青素提取的二次多元回归方程：

表3 回归 模型 方差 分析Table 3 Analysis of variance of regressi on model

从表3可以看出，模型极显著（P＜0.01），说明回归方程可以很好地描述各因素与响应值之间的真实关系，失拟项P=0.068 4＞0.05不显著，表明试验结果与数学模型拟合程度良好，可用该模型来分析和预测锁阳原花青素的提取工艺条件，相关系数R2=0.892 2，说明该模型拟合程度良好，预测值与实测值之间有较好的相关性［24］。回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验法判定，概率P值越小，则相应变量的显著性程度越高。

从表3回归方程系数显著性检验可知，一次项酶解时间（X1）、酶解温度（X3），二次项酶解时间（X）、pH值（X）、酶解温度（X）和乙醇体积分数（X）对原花青素提取率影响极显著（P＜0.01），一次项pH值（X2）、酶解时间和pH值的交互项（X1X2）对原花青素的提取率影响显著（P＜0.05），其他项影响不显著。因此，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，简单的分析方法难以解析，而响应面法能较好地描述它们之间的关系，并能较好地优化锁阳原花青素的提取工艺。

2.2.3 响应面交互作用分析

图7 各因素间交互作用对锁阳原花青素提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface plots showing the effect of interactions among different factors on the extraction yield of proanthocyanidins from Cynomorium songaricum Rupr.

根据回归方程所绘制出各因素交互作用的响应面图，其投影面为等高线图，等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反，响应面的陡峭程度也可反映交互作用的强弱［25］。由图7a可以看出，酶解时间和pH值的交互作用显著，酶解时间轴向等高线密集且变化趋势陡峭，pH值轴向等高线稀疏，变化平缓，表明酶解时间比pH值对锁阳原花青素提取率的影响较大；而由图7b～f可以看出，酶解时间与酶解温度、pH值和酶解温度、酶解时间与乙醇体积分数、pH值与乙醇体积分数、酶解温度与乙醇体积分数的交互作用不显著，但从曲面的变化趋势来看酶解温度、pH值对锁阳原花青素的提取影响较大，乙醇体积分数的影响较小。

2.2.4 最优工艺条件及验证实验

利用Design-Expert 8.0软件对试验模型进行分析，以获得锁阳原花青素提取率的最优提取工艺条件为酶解时间34.15 min、pH 4.75、酶解温度52.47 ℃、乙醇体积分数69.58%，模型预测的锁阳原花青素提取率极大值为14.25%。考虑到实际操作的便利，将各因素的参数修正为酶解时间34 min、pH 4.8、酶解温度52 ℃、乙醇体积分数70%，在此条件下进行5 次重复验证实验，锁阳原花青素平均提取率为14.30%，与理论预测值接近。因此，采用响应面分析法优化得到的工艺优化条件可行，参数准确可靠，具有实用价值。

2.2.5 酶法与乙醇提取法对锁阳原花青素提取率的比较

酶法与乙醇提取法（料液比1∶10，在70 ℃条件下，用体积分数70%乙醇溶液回流提取2 h），锁阳原花青素的提取率分别为14.30%和10.47%，相比较，酶法提取率明显提高。

3 结 论

本研究利用响应面法优化果胶酶提取锁阳原花青素工艺参数，在果胶酶质量分数为1%时，锁阳原花青素提取的最优工艺条件为pH 4.8、酶解温度52 ℃、酶解时间34 min、以体积分数为70%乙醇溶液提取1.5 h，锁阳原花青素提取率达到14.30%，对比乙醇提取法（10.47%）增加了3.83%，且高于文献［26］所报道的甘肃酒泉所产锁阳的提取率（11.50%），说明酶法提取锁阳原花青素可行；还说明同一省不同产地的锁阳中同一有效成分含量有差异；采用不同的提取方法提取率有较大差异。

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Optimization of Pectinase-Assisted Extraction of Proanthocyanidin from Cynomorium songaricum Rupr.Using Response Surface Methodology

CUI Wei1， ZHANG Yong1，2， GAO Haining1，2， JIAO Yang1， LI Caixia1，2，*
（1.College of Agriculture and Biotechnology， Hexi University， Zhangye 734000， China；2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Universities， Zhangye 734000， China）

Purpose: To optimize the pectinase-assisted extraction of proanthocyanidins （PC） from the stems of Cynomorium songaricum Rupr..Methods: Pectinase was introduced into the process for improving the extraction efficiency.The extraction conditions were optimized by using response surface methodology （RSM）.Five key factors including enzyme dosage， hydrolysis duration， pH value， temperature and ethanol concentration were selected by one-factor-at-a-time experiments.The extraction yield of PC was used as the response.Results: A quadric regression equation for predicting the extraction yield of PC was established using Box-Behnken design and the extraction conditions were optimized as follows: hydrolysis for 34 min with 1% pectinase at 52 ℃ and initial pH 4.8 followed by extraction for 1.5 h with 70% ethanol as the extraction solvent.Under these optimized conditions， the extraction yield of PC reached 14.30%.Conclusion: The optimized pectinase-assisted extraction method can enhance the extraction efficiency of PC from Cynomorium songaricum Rupr..

Cynomorium songaricum Rupr.； pectinase； proanthocyanidins； response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201614004

TQ461

A

1002-6630（2016）14-0018-06

崔玮， 张勇， 高海宁， 等.响应面试验优化果胶酶辅助提取锁阳原花青素工艺［J］.食品科学， 2016， 37（14）: 18-23.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614004. http://www.spkx.net.cn

CUI Wei， ZHANG Yong， GAO Haining， et al.Optimization of pectinase-assisted extraction of proanthocyanidin from Cynomorium songaricum Rupr.using response surface methodology［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 18-23.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614004. http://www.spkx.net.cn

2015-12-14

国家中医药管理局2012年中医药行业科研专项（201207002）

崔玮（1969—），男，副教授，硕士，研究方向为动物生理和药理。E-mail：zhangyecw@163.com

*通信作者：李彩霞（1967—），女，高级实验师，学士，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：pengli131@163.com