Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

饶华春，滕继云，刁　勇，宋沁馨，王立强，杨会勇*，周国华

(1.华侨大学 生物医学学院分子药物研究院，教育部分子药物研究中心，福建泉州362021；2.南京军区南京总医院药理科，江苏南京210002；3.中国药科大学 药物分析教研室，药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏南京210009)



Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

饶华春1，滕继云1，刁勇1，宋沁馨2,3，王立强1，杨会勇1*，周国华2*

(1.华侨大学 生物医学学院分子药物研究院，教育部分子药物研究中心，福建泉州362021；2.南京军区南京总医院药理科，江苏南京210002；3.中国药科大学 药物分析教研室，药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏南京210009)

摘要：多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的，如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点.以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象，通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5′-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid，LNA))，使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异，改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液，不同退火温度的二阶循环扩增程序)后，进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率，降低引物设计难度，也扩大了模板序列的适用范围.此外，还针对禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增，用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测，所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号.因此，采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高，具有很好的通用性和实用性.

关键词：Tm值差异型不对称PCR；单链DNA模板；单核苷酸多态性；焦磷酸测序；禽流感病毒

如何针对诸如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等难治性疾病进行防治是当前医药工作领域面临的迫切难题.目前针对这些难治性疾病的研究越来越多，新的机制和理论不断被提出，总的认识是这些疾病均与人类基因相关，在一定程度上可以说这些疾病均属于分子疾病.因此阐明这类疾病的分子机制成为有针对性制定治疗方案的前提条件.以人类疾病相关基因序列的检测与功能研究为主要任务之一的分子诊断学，可为这些疾病的分子机制研究提供方法和积累数据.其中焦磷酸测序是当前分子诊断较为常用的手段，是一种短片段DNA分析检测的理想平台.焦磷酸测序是基于DNA合成延伸反应的测序技术[1-2]，不需要电泳和荧光标记，可实时分析测序引物相邻的碱基序列，目前已在分子诊断中如基因特异位点检测[3-4]和大规模测序[5-6]、疾病相关基因检测[7-8]、病原微生物快速检测与确定[9]等领域得到广泛应用.因此本研究选择焦磷酸测序技术来检测通过优化前后不对称扩增获得的单链DNA样本制备质量，并分析其在分子诊断中的应用效果.

单链DNA样品的获取是众多分子诊断技术的关键步骤之一[1]，如探针杂交[10]、实时荧光定量PCR[11]、适体筛选[12]、生物传感器[13-14]、疾病诊断与检测[15]，甚至用于基因表达调控[16].单链DNA样品质量直接关系到以上述检测平台为基础的检测与研究结果的分析和效果评价.目前单链DNA样品制备主要采用微球捕获法[1,17]，此方法可获得单一的单链产物，但制备步骤繁琐，易发生交叉污染.一般不对称PCR被认为可以产生大量单链DNA样品，但是很多时候扩增效率并不稳定.指数线性PCR(linear-after-the-exponential-PCR，LATE-PCR)技术针对一般不对称PCR扩增技术进行了改进，将引物及扩增产物Tm计算引入到不对称PCR实验设计中[18-21],还发展为可高效率制备用于焦磷酸测序及其他分子诊断平台的单链寡核苷酸分子[22-24]，可以说LATE-PCR是一种Tm值差异型不对称扩增PCR.但是LATE-PCR要高效产生单链核苷酸分子，需限制性引物(PL)的Tm值(melting temperature of the limiting primer，TmL)、大量引物(PX)的Tm值(melting temperature of the excess primer，TmX)和扩增产物的Tm值(melting temperature of double-stranded amplicon，TmA)满足TmL-TmX≥5 ℃和TmA-TmX≤13 ℃这2个条件[23,25].经过分析和实验表明，对于很多富含AT碱基的序列以及较长的目的片段，LATE-PCR的引物设计将变得十分困难[22-23].

本研究通过分析不对称扩增体系中引物和扩增产物的Tm值，研究其与扩增效率和扩增特异性的关系，通过提高大量引物的Tm值，降低限制性引物的Tm值，优化引物设计和扩增程序，期望提高长片段和富含AT碱基的DNA片段单链产生效率，并有效简化焦磷酸测序等分子诊断方法的操作流程，建立一种低运行成本的单链DNA模板制备的Tm值差异型不对称扩增(TDA-PCR)新方法.选择BRCA1基因中3个与乳腺癌相关单核苷酸多态性(SNP1～3)[22,26-27]和rs2270517(SNP4)[28]的DNA片段为研究对象，通过对比LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法的单链扩增效率和焦磷酸测序结果，对其单链模板制备效果进行考察；同时采用TDA-PCR法制备禽流感HA基因单链模板并进行焦磷酸测序检测，以考察其对实际样品的检测效果以及在不同焦磷酸测序系统中的通用性.

1实验部分

1.1仪器与试剂

EDC-810基因扩增仪(北京东胜创新生物科技有限公司)；PowerPac1000高压电源(美国BIO-RAD公司)；GenGenius凝胶电泳成像仪(美国Syngene公司)；CUV-紫外透射仪(美国Bioimage公司)；焦磷酸测序装置由本实验室按文献[29]自行组装完成；R6335光电倍增管(日本Hamamatsu Photonics K.K.公司)；BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理研究所)；N2000色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)；PSQ96焦磷酸测序仪器(瑞典Pyrosequencing AB 公司).

TaqDNA 聚合酶、dNTPs(10 mmol/L)、10×Buffer(不含Mg2+)、MgCl2购自TaKaRa公司(大连宝生物工程有限公司)；FastStarTaqDNA聚合酶购自Roche公司(上海罗氏制药有限公司)；乙烯基吡咯烷酮(PVP)、重组荧光素酶购自美国Promega公司；牛血清白蛋白(BSA)、 5′-磷酸化硫酸腺苷(APS)和 Apyrase 购自美国Sigma公司；α-硫化脱氧三磷酸腺苷(dATPαS)、dGTP、dTTP和dCTP 购自Amersham Pharmacia Biotech公司.ATP硫化酶、Klenow 片段(无外切酶活性)由本实验室表达.所用其他化学试剂均为分析纯，所有试剂均用去离子水稀释.

本研究所用的血样由本实验室健康志愿者提供，分别编号为g-1和 g-2.血样样品的基因组DNA按照酚-三氯甲烷法提取.以BRCA1基因上3个乳腺癌相关SNPs和rs2270517为对象，分别标记为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4.禽流感病毒H5N1的基因组DNA从江苏省疾病控制中心获得.

本研究所涉及的核苷酸片段序列均来自NCBI网站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，包含rs2270517 位点相关序列(AC104581.22)、3个BRCA1基因的SNPs相关序列(NT_010755.15)、禽流感病毒H5N1的HA基因序列(CY098853.1)；引物设计使用Primer 5.0软件，Tm值计算采用在线软件Oligo Analyzer 3.0 (http:∥scitools.idtdna.com/calc/analyzer，参数按实际值输入，如一价阳离子浓度50 mmol/L，PX浓度为1 μmol/L，PL浓度为0.1 μmol/L)；锁核甘酸(LNA)修饰的引物设计采用Exiqon公司的在线LNA设计和分析工具(http:∥lna-tm.com/).LNA修饰的引物由TaKaRa公司合成，其他引物均由Invitrogen公司(上海英骏生物有限公司)合成.

1.2实验方法

1.2.1PCR扩增反应体系与扩增程序

反应体系总体积25 μL，包括：3 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTPs、1.5 UTaqDNA 聚合酶、1 mmol/L引物PX、100 nmol/L引物PL、2.5 μL 10×PCR buffer(50 mmol KCl、 15 mmol Tris-HCl、 pH 8.0)、13%(体积分数)甘油、0.48%(质量分数)BSA.

PCR反应程序：95 ℃ 5 min;87 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，30个循环；87 ℃ 10 s，66 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，30个循环；72 ℃ 10 min；16 ℃维持.其中第一扩增循环的退火温度比TmL低1～2 ℃，第二扩增循环比TmX的低1～2 ℃.采用2%～3%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，染料为Goldview(北京赛百盛基因技术有限公司)，用量5 μL/100 mL.

1.2.2PCR产物电泳条带面积与强度检测

将PCR产物电泳图在ImageJ软件打开，改变图片的类型，降低背景的影响；在每个泳道选定待分析的目的条带，选择相同大小的区域进行分析，生成曲线图；对特定条带进行积分计算，得该区域的积分面积后，计算此部分条带的强度.

1.2.3单链模板制备及焦磷酸测序

焦磷酸测序模板的制备和焦磷酸测序过程均按照文献[22]进行，包括反应液配制、PCR产物处理、焦磷酸测序3个步骤.

2结果与讨论

2.1TDA-PCR反应效率分析与条件优化

2.1.1TDA-PCR反应机理分析

相对于普遍使用的微球捕获法，不对称PCR曾被认为是制备DNA单链分子较为理想的方法，但其产生单链DNA产物的效率很低[18]，因为在指数扩增阶段，限制性引物的消耗降低了其与模板的退火效率，而使线性扩增阶段用来扩增模板数量较少；在线性扩增阶段，不断增多的单链扩增产物与大量引物竞争性结合扩增模板，导致单链产生效率降低.LATE-PCR方法注意到了引物浓度变化对Tm值的影响[18]，发现只有满足TmL-TmX≥0 ℃和TmA-TmX≤18 ℃2个条件才能获得较好的单链扩增效率[25].而在已报道的用于焦磷酸测序的LATE-PCR反应中，这个条件进一步被优化成TmL-TmX≥5 ℃和TmA-TmX≤13 ℃[23]；但依据这个条件，浓度低的引物需要较高的Tm值，因此要扩增较长的靶片段或引物退火区域富含AT碱基的靶序列，引物设计十分困难，这限制了LATE-PCR的应用范围.

为了解决这个问题，在充分研究LATE-PCR反应机制的基础上，尝试并逐步改进这种不对称扩增方法，改变LATE-PCR中PX和PL的浓度比值，PX采用高浓度而PL采用低浓度.从表1可以看出：同样序列的引物，按照LATE-PCR计算TmL-TmX的值多在1～3 ℃，而在TDA-PCR体系中其值则可达5～10 ℃.在指数扩增阶段，TDA-PCR采用低温退火温度(比TmL低1～2 ℃)和充分的循环反应来增加PL的退火效率和反应效率.由于PX的Tm值较高，理论上非特异性扩增的风险将增加，本研究通过优化PCR增强剂配比以及改进扩增反应程序克服了这一问题.在线性扩增阶段，扩增产物与引物PX仍会竞争结合扩增模板，则TmA-TmX≤13 ℃仍是高效率扩增单链的必要条件；但在TDA-PCR中，PX因浓度高，TmX比LATE-PCR中更易接近TmA，引物设计时相对容易，相同条件下，对长片段有较高的单链扩增效率.

2.1.2TDA-PCR的引物设计与PCR条件的优化

为了能使限制性引物有效地与模板退火，本研究选取了先低温(比TmL低3～5 ℃)、后高温(比TmX低1～2 ℃)的扩增程序；先使PL在线性扩增基本消耗完全，再在线性扩增阶段增高温度以增加反应特异性，且使Tm值低的PL无法再与模板退火，从而产生大量单链产物.有关循环数的选择，LATE-PCR方法在指数循环阶段选择25个循环[25]，本研究对循环数进行了优化，发现在所建立的TDA-PCR反应中30个循环效果更好；根据研究发现TaqDNA聚合酶在55个循环后还有一半活性，通过降低变性温度和增添PCR增强剂来保持其活性，线性扩增阶段反应也优化为30个循环.

为了进一步优化扩增效率，本研究在引物设计中还引入了可有效增加Tm值的LNA.LNA是新型的核酸类似物，适用于所有的4种核苷酸，且能够显著提高双链稳定性.研究认为寡核苷酸序列中每增加1个单体LNA分子将使Tm升高2～8 ℃[30]，而引物与模板结合的特异性却不会因为碱基数增加而降低，因此特别适合TDA-PCR反应.本文所设计的LNA修饰引物长度和相应Tm值见表1.

2.1.3TDA-PCR的单链扩增效率分析

为了验证LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法对不同片段的扩增效率，设计了包含不同SNP位点的不同长度DNA片段进行扩增，结果见图1(2%琼脂糖凝胶，Goldview荧光染料).该荧光染料结合单链呈现淡红色，结合双链为绿色.从结果可以看出，对于不同长度目的片段的扩增，TDA-PCR产物可以看到绿色双链条带和淡红色单链条带(泳道1～7)，

表1　TDA-PCR和LATE-PCR所用的引物和焦磷酸测序引物Tab.1　Primers for TDA-PCR，LATE-PCR and pyrosequencing

注：1) 在引物S4-LNA中，大写字母表示的碱基为LNA，小写字母表示正常碱基；2) 部分引物中下划线标示的碱基为引入的突变碱基(引突变碱基目的主要是调整引物Tm值，使PL的Tm值尽可能高些，使TmL与TmX以及TmX与TmA的差值尽可能大些，从而能够更符合高效进行不对称扩增的条件，增大这些扩增方法的适用范围)；3) 产物名称中F开头的表示本文所建立的TDA-PCR方法扩增，L开头的表示LATE-PCR方法扩增；4) 测序引物部分，产物名称一栏表示用此扩增片段制备的单链DNA为测序模板，对应的引物为测序引物.

泳道1～7为采用新建立的TDA-PCR方法扩增目的 片段的结果，泳道8～11为采用LATE-PCR 方法扩增目的片段的结果.M为DNA分子质量标准.图1　包含SNP1～4的不同长度产物的LATE-PCR 和TDA-PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1Agarose gel electrophoretogram results of the amplicons containing SNP1-4 respectively using TDA-PCR and LATE-PCR methods

而LATE-PCR产物同样可以看到红色和绿色条带(泳道8～11)，但TDA-PCR与相对应的LATE-PCR扩增产物相比红色条带更亮.为了验证TDA-PCR的单链扩增效率是否高于LATE-PCR，用ImageJ软件对图1中目的条带强度进行了分析，结果见表2，除Fs2和Ls2较接近外，其他均是TDA-PCR的条带强度高于LATE-PCR，这也证明了本研究建立的TDA-PCR

表2　采用ImageJ软件对图1目的 电泳条带进行强度分析结果Tab.2　The results of intensity analysis of the target electrophoresis bands in Fig.1 by ImageJ tool

体系扩增效率较高，特异性较好.

通过对TDA-PCR条件进行优化，包括DNA聚合酶的选择(非热启动DNA聚合酶)，退火温度(指数扩增比TmL低1～2 ℃，线性扩增比TmX低1～2 ℃)、变性温度(比TmA高5～10 ℃)、循环数(指数扩增阶段30个循环，线性扩增阶段30个循环)、延伸时间的估算(根据1 000 bp/min)以及添加PCR增强剂(13%(体积分数)甘油，0.48%(质量分数)BSA)，建立了一种可以使用非热启动DNA聚合酶进行TDA-PCR扩增的体系.

2.2TDA-PCR扩增产物的焦磷酸测序检测

2.2.1包含BRCA1基因SNP目的序列的焦磷酸测序

(a)用PSQ96焦磷酸测序系统对Fs3片段部分序列的测序结果，dNTP加入的顺序是：GATCGATCGATCGATC；(b)用自制 焦磷酸测序仪对Fs3片段部分序列的测序结果，dNTP加入的顺序是：GTCATGCAATACGAA；(c)和(d)包含SNP2的DNA 片段的焦磷酸测序结果，dNTP加入的顺序是：TGAGCTCGAGATCATG(对Ls2)和GGAACGTCCTTCTT(对Fs2)；(e)和(f)包含 SNP3的DNA片段的焦磷酸测序结果，dNTP加入的顺序是：AGTCTGATTCGAGAAG(对Ls3)和GTACTCGATAGG(对Fs3).图2　包含SNP2和SNP3 扩增产物的焦磷酸测序结果Fig.2Comparative results of pyroseuquencing analysis of the amplicons containing SNP2 and SNP3

首先检测了采用TDA-PCR制备的模板在不同仪器上的适用性，对包含SNP3的目的片段进行不对称扩增，然后按照文献[22]步骤制备焦磷酸测序模板，准备焦磷酸测序用试剂，在商品化的PSQ96焦磷酸测序仪和自制磷酸测序仪上同时进行测序，结果如图2所示.从图中结果可以看出，PSQ96焦磷酸测序系统(图2(a))与自制焦磷酸测序仪(图2(b))结果一致，采用自制焦磷酸测序仪所获得的结果信号要好于PSQ96系统，说明采用TDA-PCR方法制备的单链可以在不同焦磷酸测序平台上使用，具有很好的通用性.然后又分别采用LATE-PCR法和本研究所建立的TDA-PCR法对包含SNP2和SNP3的序列分别进行不对称扩增，并用自制焦磷酸测序仪进行检测，均能获得较为理想的结果(图2(c)～(f)).所获得的SNP基因型结果一致，SNP2附近序列的LATE-PCR产物Ls2测得结果为A￣A￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣G￣A￣C￣A￣G￣，A￣A￣后无C￣插入(no ins C)；T￣DA￣-PC￣R产物Fs2测得结果为G￣G￣G￣A￣T￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣，A￣后无G￣的插入(no ins G).SNP3附近序列的LA￣T￣E-PC￣R产物Ls3测得结果为T￣C￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣G￣A￣A￣G￣，基因型为C￣C￣；T￣DA￣-P￣C￣R产物Fs3测得结果为G￣G￣G￣A￣T￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣，基因型为G￣G￣.

为了检测不同长度扩增片段对焦磷酸测序效果的影响，本研究扩增了包含SNP1的不同长度片段产物(见图1)，然后分别对这些产物进行焦磷酸测序检测，图3结果显示TDA-PCR和LATE-PCR法扩增获得单链产物，对SNP1测得的基因型一致，其中不同样品检测到了SNP1的GG纯合型(样品g-1，图3(a)、(c)、(d)和(f))和A/G杂合型(样品g-2，图3(b)和(e))的样本.结果显示在对短片段扩增产物进行焦磷酸测序时，2种方法均能获得较为理想的结果；但是对于长片段的产物，TDA-PCR法获得的产物测序信号没有明显衰减，而LATE-PCR法获得的产物则出现明显衰减，这也证明了TDA-PCR法扩增对于焦磷酸测序检测较长DNA片段时具有优势.

2.2.2LNA修饰引物扩增产物的焦磷酸测序

dNTP加入的顺序：TCAGAGTCAT(对Fs1和Fsb1)和TCGTTGCAA(对Ls1和Lsb1).图3　采用LATE-PCR和TDA-PCR制备包含SNP1的不同长度扩增产物的焦磷酸测序结果Fig.3The pyrograms of the different length products containing SNP1 amplified by LATE-PCR and TDA-PCR

为了能够更好地通过焦磷酸测序对扩增获得单链模板质量进行检测，分别采用LATE-PCR和TDA-PCR法扩增包含SNP4的不同长度目的片段，然后采用同一测序引物进行焦磷酸测序检测，图4是将LATE-PCR、TDA-PCR、LNA修饰引物的TDA-PCR扩增产物分别进行焦磷酸测序的结果.

dNTP加入顺序：GCAGCAGCGTAGATG.图4　采用不同不对称扩增方法制备包含SNP4位点的单链DNA产物的焦磷酸测序结果Fig.4The pyrograms of the ssDNA products containing SNP4 amplified by different asymmetric amplification methods

由图4结果可知，样品g-1测得序列为AGC(A/G)TGGTAGGAG，SNP4可明显判读为杂合型，而且3种方法处理样品获得的结果一致.在扩增产物长度为99 bp时，TDA-PCR和LATE-PCR产物信号强度相差不大(图4(a)和(b))；但是在156 bp时，TDA-PCR信号要远好于LATE-PCR(图4(d)和(e))；经过LNA修饰后，95或152 bp产物的信号均较高，且扩增片段长度增加时信号并没有明显下降(图4(c)和(f)).结果表明含有2个LNA的24 bp引物能获得和28 bp长序列引物相当的效果，在焦磷酸测序样品检测中甚至优于长引物的扩增产物.由于LNA修饰引物会引起成本的增加，因此只有在TDA-PCR无法扩增出较好结果时才考虑使用.

2.3禽流感HA基因保守序列的检测

禽流感病毒H5N1致病性很强，能在极短的时间内使大量禽畜死亡，并有可能致人类死亡.其大规模的流行，不仅造成了相关产业的巨大损失，而且由于可传染人而造成人们极大心理恐慌，因此发展一种准确快速诊断方式对这种病毒的防治具有很大意义.本研究选择禽流感H5N1的HA基因中一段保守序列[31]，采用TDA-PCR法扩增制备单链并进行焦磷酸测序，以期望建立一种较为快速和准确高效的H5N1病毒检测方法.

(a)采用TDA-PCR扩增H5N1的HA基因部分DNA片段序列(FHA1)的电泳结果；(b)TDA-RCR扩增产物制备单链 DNA模板后采用自制的焦磷酸测序仪进行测序分析结果；(c)采用经典的磁珠单链制备法和商品化PSQ96焦磷酸 测序仪对HA基因特征序列的焦磷酸分析结果.焦磷酸分析时2种方法dNTP加入顺序均为：ATCCTACGTCTTAGCTC.图5　禽流感病毒H5N1的HA基因TDA-PCR扩增产物的电泳及焦磷酸测序结果Fig.5Agarose gel electrophoretogram and pyrogram results of the HA gene conserved sequence of the H5N1 avian influenza virus amplified by TDA-PCR and sequenced by pyrosequencing

首先根据H5N1的HA基因序列设计引物(见表1)并进行LATE-PCR扩增，结果如图5(a).采用TDA-PCR扩增出的HA基因目的片段(FHA1，197 bp)仅有一条目的带，可以用来进行焦磷酸测序反应.为了验证TDA-PCR法制备单链的质量和通用性，同时采用自制焦磷酸测序仪和商品化的PSQ96焦磷酸测序系统对目的片段进行了测序.从结果(图5(b)和(c))看，2种焦磷酸测序系统所获得的结果一致，根据测得序列可判定所扩增的目的片段为禽流感的HA基因.本研究采用TDA-PCR法制备的单链DNA模板获得的焦磷酸测序结果，与用当前通行的磁珠捕获法得到的效果相近，但制备流程大大简化，成本也大为降低，除检测禽流感病毒特异性基因外，还可应用于单细胞等实际样本的检测[32].

3结论

自从LATE-PCR扩增用于焦磷酸测序制备以后，即被认为是一种很有效的寡核苷酸单链制备方法，与当前通行的磁珠法相比，操作流简单，效率高；但是由于引物设计要求较高，使得其在某些富含AT碱基的片段和长片段扩增中的应用受到限制.本研究在LATE-PCR基础上，通过改进引物设计和优化PCR方法，建立了新的TDA-PCR方法，能够有效地提高不对称扩增效率，特别是对于较长的目的片段.焦磷酸测序结果表明TDA-PCR扩增的片段能获得较高的测序信号，可清晰判读目标序列；而相同条件下，LATE-PCR产物的焦磷酸测序信号则出现了明显下降甚至出现判读困难.通过进一步检测验证，TDA-PCR方法所制备的单链可用于不同焦磷酸测序系统，也可用于实际样品的检测，证明这种方法具有良好的通用性和实用性.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201506017

收稿日期：2015-06-17录用日期：2016-01-18

基金项目：国家自然科学基金(31200979，81271691，82170734，30973591)；国家国际科技合作项目(2011DFG33320)；福建省自然科学基金(2016Y0063)；江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20151445)；中国博士后科学基金(2012M512179，2013T6092)；中国博士后科学基金特别资助(2013T60962)；药物质量与安全预警教育部重点实验室项目(MKLDP2013MS01)；江苏省青蓝工程项目；中央高校基本科研业务费专项(ZQN-PY319，2015ZD008)；华侨大学高层次人才启动项目(09BS624)

*通信作者：ghzhou@nju.edu.cn(周国华)；shyhy@hqu.edu.cn(杨会勇)

中图分类号:Q 755

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)04-0485-10

Establishment of the Tm Difference Asymmetric PCR Method and Its Application in Molecular Diagnosis

RAO Huachun1，TENG Jiyun1,DIAO Yong1，SONG Qinxin2,3，WANG Liqiang1，YANG Huiyong1*，ZHOU Guohua2*

(1.Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education,Institute of Molecular Medicine，School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China;2.Department of Pharmacology，Jinling Hospital，Nanjing University，School of Medicine，Nanjing 210002，China;3.Key laboratory of Drug Quality Control and Pharmacorigilance,Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:Detection of single-stranded DNA (ssDNA) is the basis of many molecular diagnostic methods，and how to obtain enough and high quality ssDNA has been one of the hot research topics.In this paper, several sections of DNA (containing one of the three SNPs of BRCA1 gene respectively) were as the research subjects，we carefully optimized the sequences of primers (introducing mismatch bases at the 5′-end of the primers or introducing locked nucleic acid (LNA) into excess primers) and adjusted the concentration of the primers (10 times difference between the excess primer and the limiting primer) to generate the difference of Tm between the excess primer and the limiting primer (3-8 ℃)，and the amplification program was also improved (some PCR enhancers were added into the reaction mixture and a two-stage amplification procedure with two annealing temperatures)，then the Tm difference asymmetric PCR (TDA-PCR) method was used and a large number of target ssDNA molecules were produced.The results showed that TDA-PCR could steadily increase the productivity of the ssDNA molecules，and it became easier than linear-after-the-exponential-PCR (LATE-PCR) for the easier primer designing and the more target DNA producing.This assay amplified the conserved sequence of the influenza HA gene using TDA-PCR，and pyrosequencing method was used to detect the conserved sequence.The pyrograms obtained were of high quality and consistent with the reference sequence，indicating that TDA-PCR not only prepares ssDNA templates for pyrosequencing more easily and more efficiently，but also has good practicality and versatility.

Key words:Tm difference asymmetric PCR (TDA-PCR);single-stranded DNA template;single nucleotide polymorphism;pyrosequencing;Avian influenza virus

引文格式：饶华春，滕继云，刁勇，等.Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用[J].厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(4)：485-494.

Citation：RAO H C，TENG J Y，DIAO Y,et al．Establishment of the Tm difference asymmetric PCR method and its application in molecular diagnosis[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：485-494．(in Chinese)